Las proyecciones prefrontales al núcleo reuniens señalan la relevancia conductual de los estímulos durante el aprendizaje asociativo

May 28, 2023

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 11995 (2022) Citar este artículo

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El núcleo reuniens (RE) es necesario para los recuerdos que dependen de la interacción entre la corteza prefrontal medial (mPFC) y el hipocampo (HPC). Un ejemplo es el condicionamiento de parpadeo, en el que la mPFC muestra una actividad diferencial frente a estímulos condicionados neutros (CS) en función de su contingencia con un estímulo incondicionado (US) aversivo. Para probar si esta señal de relevancia se enruta al RE, registramos fotométricamente terminales de axón mPFC dentro del RE y rastreamos sus cambios con el aprendizaje. Como comparación, medimos la actividad terminal prefrontal en el tálamo mediodorsal (MD), que carece de conectividad con el HPC. En ratas macho ingenuas, las terminales prefrontales dentro del RE no se activaron fuertemente por el tono o la luz. A medida que las ratas asociaban uno de los estímulos (CS+) con el US, los terminales aumentaban gradualmente su respuesta al CS+ pero no al otro estímulo (CS-). Por el contrario, las respuestas provocadas por estímulos de las terminales prefrontales dentro del MD eran fuertes incluso antes del condicionamiento. También se aumentaron solo a CS+ en la primera sesión de acondicionamiento; sin embargo, el grado de diferenciación de actividades no mejoró con el aprendizaje. Estos hallazgos sugieren que el aprendizaje asociativo aumentó selectivamente la salida de mPFC al RE, lo que indica la relevancia conductual de los estímulos sensoriales.

La capacidad de formar asociaciones entre señales ambientales y resultados destacados es un proceso cognitivo crucial del que dependen los organismos para adaptarse y sobrevivir. Este proceso de aprendizaje asociativo se estudia con frecuencia utilizando paradigmas de condicionamiento clásico. En particular, el condicionamiento de trazo de parpadeo (TEBC, por sus siglas en inglés) evalúa la capacidad del sujeto para asociar un estímulo sensorial neutral (conocido como estímulo condicionado [CS]) con un shock palpebral levemente aversivo (conocido como estímulo no condicionado [US]) que se presenta después de un breve intervalo de tiempo (conocido como intervalo de seguimiento). En consecuencia, la inclusión de este retraso temporal requiere la integridad de las regiones del prosencéfalo, incluidos el hipocampo (HPC)1,2,3 y la corteza prefrontal medial (mPFC)4,5,6,7, además de los circuitos motores del cerebelo y el tronco encefálico8 ,9. Además, la formación de estas asociaciones de estímulo CS-US está acompañada por el desarrollo de patrones de activación selectiva para las asociaciones en el HPC10,11 dorsal y mPFC12,13,14,15. Además, con el aprendizaje, la mPFC desarrolló una actividad oscilatoria de banda gamma y theta evocada por estímulos más fuerte16,17,18. Además, la actividad de la banda theta de mPFC se acopla temporalmente con la actividad de la banda theta de HPC19. En conjunto, estos hallazgos sugieren que la estrecha interacción entre mPFC y HPC es esencial para la formación de asociaciones de estímulo en TEBC.

Hay varias vías anatómicas que pueden apoyar la interacción mPFC-HPC. Aunque las proyecciones monosinápticas se originan desde el HPC ventral hacia el mPFC, el mPFC carece de proyecciones excitatorias monosinápticas hacia el HPC20,21. En cambio, el mPFC puede influir en la actividad neuronal de HPC a través de varias vías multisinápticas que involucran estructuras intermedias. Se cree que el núcleo reuniens de la línea media del tálamo (RE) es una de estas regiones intermedias22,23,24, ya que posee conexiones anatómicas recíprocas con mPFC y HPC25,26,27. Estudios previos han demostrado que el RE es fundamental para apoyar la sincronicidad mPFC-HPC28,29,30 y el rendimiento en tareas que requieren interacción mPFC-HPC, como la evitación pasiva31, navegación espacial32,33, tareas de memoria de trabajo espacial28,34, condicionamiento contextual del miedo35, 36,37,38 y tareas de memoria de secuencias39. En particular, la formación de asociaciones de estímulo en TEBC se vio afectada por la estimulación eléctrica de alta frecuencia del RE durante los primeros dos días de condicionamiento en ratones40.

Aunque la evidencia antes mencionada respalda la necesidad del RE para facilitar la interacción mPFC-HPC que subyace en varias formas de procesos cognitivos, aún se desconoce qué tipo de información se transmite dentro de la vía mPFC-RE-HPC y, más específicamente, el grado de qué salida de mPFC está relacionada con las características relacionales y físicas de un estímulo. Para abordar este punto, realizamos registros fotométricos de la dinámica del calcio en los axones de las neuronas mPFC que terminan dentro del RE mientras las ratas se sometieron a TEBC. El uso de TEBC permite un control preciso sobre el tiempo y la contingencia del estímulo, lo que nos permite diferenciar los patrones de actividad selectivos para las características del estímulo sensorial y relacional, así como su correlación con el desempeño de la tarea. Como comparación, investigamos los cambios relacionados con el aprendizaje en la actividad de los axones mPFC que terminan dentro del tálamo dorsal medial (MD). El MD es un control ideal basado en su especificidad de proyección, ya que recibe fuertes proyecciones monosinápticas del mPFC41,42,43 pero no proyecta al HPC44,45. Encontramos que las salidas prefrontales al RE y MD fueron selectivas para las asociaciones de estímulo; sin embargo, solo el primero aumentó su selectividad con el aprendizaje.

Un total de 40 ratas macho Long-Evans (Charles River Laboratories), de 77 días de edad a su llegada, se alojaron individualmente en jaulas de plástico transparente en una habitación de colonia doméstica y se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad inverso de 12 h (oscuridad de 10: 00 a 22:00) con libre acceso a comida y agua. Sus pesos tres semanas después de su llegada oscilaban entre 375 y 410 g. Las razones para el uso de ratas macho únicamente fueron: (1) las diferencias de sexo en las capacidades de aprendizaje del condicionamiento del parpadeo debido a las hormonas ováricas46, y (2) los estudios previos que examinaron la función y la actividad de la mPFC en TEBC se realizaron exclusivamente con ratas macho7,12,16, 17 Los experimentos de comportamiento se realizaron durante el ciclo oscuro. Se utilizaron un total de 22 ratas en el Experimento 1 (inactivación farmacológica del RE) y 18 ratas en el Experimento 2 (fotometría). En el Experimento 1, se retiraron cinco ratas debido a una cánula mal dirigida, dejando 17 ratas para el análisis de datos de comportamiento. En el Experimento 2, se eliminaron cuatro ratas debido a fibras ópticas mal dirigidas y se eliminó una rata debido a la rotura del núcleo interno de la fibra durante el condicionamiento conductual, lo que dejó un total de 13 ratas para el análisis de datos fotométricos y de comportamiento. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de la Salud (Publicación N.° 85–23, revisada en 1985), el Consejo Canadiense sobre el Cuidado de los Animales, el estándar ético de la APA, las pautas ARRIVE y aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Toronto (AUP20011400).

Las ratas utilizadas en el Experimento 1 se sometieron a un procedimiento quirúrgico que implicaba la implantación de una cánula de infusión y cables oculares. Las ratas utilizadas en el Experimento 2 se sometieron a dos procedimientos quirúrgicos, primero una cirugía de infusión de vector viral, seguida de una cirugía de implantación de fibra óptica y cable ocular.

Tres semanas después de su llegada a las instalaciones, las ratas del Experimento 2 se anestesiaron (2,0–2,5 % de isoflurano por volumen en oxígeno a una velocidad de flujo de 0,8 l/min; Halocarbon Laboratories) y se colocaron en un marco estereotáxico. Se retrajeron la piel y el tejido por encima del cráneo y se perforó un orificio en ambos hemisferios por encima de la mPFC. Se utilizó una aguja de infusión de acero inoxidable 30G conectada a una microjeringa (Hamilton) a través de un tubo de polietileno para administrar AAV9.CAG.GCaMP6f.WPRE.SV40 (Addgene) en estas coordenadas: anteroposterior (AP) = + 2,7, mediolateral (ML) = ± 0,55, dorsoventral (DV) = − 3,9 mm desde bregma. El vector viral (0,75 μl/hemisferio) se inyectó a una velocidad de 0,1 μl/min. La aguja se dejó en el lugar durante cinco minutos después de completar la inyección, luego se retrajo a DV = − 3,7 mm y se dejó allí durante cinco minutos más para asegurar la difusión exitosa del vector. Luego se retrajo lentamente la aguja y se suturó la incisión. Las ratas fueron tratadas con un analgésico (carprofeno, 5 mg/kg, subcutáneo) durante 48 h después de la cirugía. Las ratas se alojaron en su jaula doméstica durante dos meses después de la cirugía para permitir la incubación y expresión viral.

Para el Experimento 1, cinco semanas después de su llegada a las instalaciones, las ratas se anestesiaron con isoflurano y se colocaron en un marco estereotáxico. Se retrajo la piel y el tejido por encima del cráneo y se perforó un orificio por encima del RE en el hemisferio derecho (AP = − 2,1, ML = + 2,0 mm desde bregma). Se bajó una cánula guía (Plastics One) a través del orificio dirigido al OD y se tapó con un estilete ficticio (AP = − 2,1, ML = + 2,0, DV = − 6,5 mm desde bregma en un ángulo de 15º en la línea media). La cánula se fijó al cráneo con tornillos de acero inoxidable y acrílico dental. La cánula de infusión que se usa para administrar los medicamentos sobresale 1 mm más allá de la punta de la cánula guía. Se implantaron subcutáneamente cuatro cables de acero inoxidable recubiertos de teflón unidos a una tapa de conector (Plastics One) en el orbicular de los párpados superior izquierdo (músculo del párpado) para registrar la actividad del electromiograma (EMG) y administrar una descarga periorbitaria. Se instaló un tornillo de tierra de acero inoxidable en el hueso parietal derecho y se conectó a la tapa del conector. La tapa del conector y el tornillo de puesta a tierra se aseguraron al cráneo con tornillos de acero inoxidable y acrílico dental. Las ratas se trataron con un analgésico (carprofeno, 5 mg/kg, subcutáneo) durante 48 h después de la cirugía y se dejaron en su jaula durante una semana para recuperarse.

Para el Experimento 2, después de la incubación viral, las ratas se anestesiaron con isoflurano y se colocaron en un marco estereotáxico. Se retrajo la piel por encima del cráneo y se taladraron orificios bilateralmente por encima del RE (AP = − 2,1, ML = ± 2,0 mm desde bregma) o MD (AP = − 2,6, ML = ± 2,1 mm desde bregma). Se implantaron fibras ópticas (NA 0,48, tamaño de núcleo de 400 µm, FP400URT, Thorlabs) unidas a casquillos de acero inoxidable (Ø2,5 mm, Thorlabs) dirigidas a RE (AP = − 2,1, ML = ± 2,0, DV = − 7,3 mm desde bregma en un ángulo de 15º) o MD (AP = − 2,6, ML = ± 2,1, DV = − 6,35 mm desde bregma en un ángulo de 15º). Las fibras ópticas se fijaron al cráneo mediante tornillos de acero inoxidable y acrílico dental. A continuación, las fibras ópticas se taparon con una tapa antipolvo protectora (Thorlabs). Luego se instaló la tapa del conector con sus cuatro cables de ojo y un tornillo de conexión a tierra siguiendo el mismo protocolo que en el Experimento 1. El cuidado quirúrgico posterior a la implantación fue idéntico al del Experimento 1.

En el Experimento 1, el paradigma conductual abarcó un total de 12 días. Los primeros dos días implicaron acostumbrar a las ratas a la cámara de acondicionamiento y los procedimientos, mientras que los siguientes 10 días involucraron el entrenamiento en la versión uno de un paradigma diferencial de condicionamiento de parpadeo de seguimiento (DTEBC1). Durante los días de habituación (H1 a H2), las ratas se colocaron dentro de un recipiente cilíndrico de plástico (21 cm de diámetro) alojado dentro de una cámara atenuadora de sonido y luz, en ausencia de estímulos, durante 50 min. A partir del día tres, las ratas se sometieron a DTEBC1 en el que se les presentaron dos tipos de prueba diferentes. En el primer tipo de prueba, se emparejó un estímulo de tono condicionado (TCS+, 100 ms, 2,5 kHz, 85 dB) con un choque leve en el párpado (estímulo no condicionado [EE. UU.], 100 ms, 100 Hz) separados por un estímulo de 500 ms -intervalo libre. En el segundo tipo de ensayo, se presentó solo un estímulo condicionado por luz (LCS-, 100 ms, 50 Hz). Aunque no contrapesamos los estímulos en el Experimento 1, confirmamos con el Experimento 2 que las ratas asocian el tono y la luz con los EE. UU. de manera comparable, independientemente de cuál de los dos estímulos se emparejó con los EE. UU. Las sesiones diarias de acondicionamiento consistieron en un total de 100 pruebas, y cada prueba tenía un 50 % de posibilidades de ser una prueba TCS+ o una prueba LCS-. La presentación del tipo de ensayo fue aleatoria, de modo que la rata no sabía qué ensayo se presentaría a continuación. Los intervalos entre ensayos se pseudoaleatorizaron entre 20 y 40 s con una media de 30 s. Cada sesión de acondicionamiento duró aproximadamente 50 min.

El tiempo y la entrega del estímulo fueron controlados por una microcomputadora (Arduino Mega, Arduino). El estímulo de tono se presentó a través de un altavoz montado en el techo dentro de la cámara, el estímulo de luz se presentó a través de un LED instalado a la altura de los ojos en el costado de la cámara, y el US, que se entregó al párpado a través de cables oculares implantados, fue impulsado por un aislador de estímulo (ISO-Flex, AMPI). El nivel de descarga de EE. UU. se fijó inicialmente en 0,3 mA y se ajustó individualmente para cada rata para inducir la respuesta no condicionada (un parpadeo/giro de cabeza), que se controló a través de cámaras infrarrojas montadas dentro de las cámaras.

La respuesta condicionada (RC) se definió como respuestas de parpadeo provocadas durante una ventana de 200 ms inmediatamente antes del inicio de los EE. UU. Esta misma ventana de tiempo se utilizó en ensayos en los que EE. UU. estuvo ausente. Los parámetros anteriores se eligieron en base a nuestro trabajo anterior, que mostró que durante 10 sesiones, las ratas aumentaron constantemente la proporción de ensayos en los que expresaron un CR18,19. Las respuestas de parpadeo se controlaron registrando la actividad EMG del músculo orbicular de los párpados superior izquierdo a través de dos cables de acero inoxidable implantados quirúrgicamente. La actividad de EMG se filtró con paso de banda entre 0,3 y 3,0 kHz, se digitalizó a 6102 Hz y se almacenó mediante un sistema de grabación RZ-5 (Tucker-Davis Technologies).

En el Experimento 2, el paradigma conductual abarcó un total de 13 días. Los primeros dos días consistieron en habituar a las ratas a la cámara de acondicionamiento y los procedimientos, el tercer día involucró pruebas de respuesta a estímulos ingenuos y los siguientes 10 días involucraron el entrenamiento en la versión dos de un paradigma diferencial de condicionamiento de parpadeo de seguimiento (DTEBC2). Los días de habituación uno y dos fueron idénticos a los del Experimento 1 excepto que la duración de cada sesión fue de 75 min. En el tercer día (Sesión 0) las ratas se colocaron dentro de sus cámaras de acondicionamiento para pruebas de respuesta de estímulo ingenuo. A las ratas se les presentaron tres tipos de prueba, el tipo uno involucró la presentación de un estímulo de tono neutral (TS) por sí mismo, el tipo dos involucró la presentación de un estímulo de luz neutral (LS) por sí mismo, y el tipo tres involucró la presentación de EE. UU. por sí mismo. La sesión 0 constaba de 150 ensayos en total, con 50 ensayos asignados a cada tipo. A partir del día cuatro (sesiones uno a 10), las ratas se sometieron a DTEBC2, en el que se entrenaron en condicionamiento reforzado con tono (cinco ratas RE y cinco MD) o reforzado con luz (una rata RE y dos MD). A las ratas con acondicionamiento reforzado con tono se les presentaron tres tipos de prueba diferentes. En el primer tipo de ensayo, se emparejó un estímulo de tono neutro con el US, separado por un intervalo libre de estímulo de 500 ms (estímulo condicionado más y US [CS+US]). En el segundo tipo de ensayo, se presentó solo el mismo estímulo de tono (estímulo condicionado más [CS+]). En el tercer tipo de ensayo, se presentó solo un estímulo de luz neutra (estímulo condicionado menos [CS-]). Las ratas entrenadas en condicionamiento reforzado con luz también tenían tres tipos de prueba; sin embargo, las identidades de los estímulos se intercambiaron, de modo que las pruebas CS+US ahora emparejaban la luz con el choque, las pruebas CS+ eran la luz presentada sola y las pruebas CS- eran el tono presentado solo. Las sesiones diarias de acondicionamiento consistieron en un total de 150 ensayos, los ensayos CS+US ocurrieron con un 68 % de probabilidad, mientras que los ensayos CS+ y CS- ocurrieron cada uno con un 16 % de probabilidad. Para la Sesión 0 y las sesiones 1 a 10, cada sesión duró aproximadamente 75 minutos, los intervalos entre ensayos y la aleatorización del tipo de ensayo fueron similares al Experimento 1.

La inclusión de los ensayos de CS solo nos permitió examinar el cambio de la señal fotométrica evocado puramente por el CS en ausencia de cualquier contaminación del cambio de señal evocado por los EE. UU. Esto nos permitió medir mejor el cambio en la actividad evocada por CS a medida que las ratas formaban asociaciones de estímulo diferencial.

Todos los análisis se realizaron utilizando código personalizado escrito en MATLAB (versión 2021a, Mathworks)18,19. Para cada sesión por rata, se calculó la amplitud de la señal EMG durante cada intervalo de tiempo de 1 ms restando la señal mínima de la señal máxima durante ese intervalo. La amplitud de EMG se promedió durante una ventana de 300 ms antes del inicio de CS en cada ensayo. La línea de base se estableció como la mediana de la amplitud EMG promediada más una desviación estándar. La actividad EMG por encima del umbral se promedió durante el período de 300 ms antes del inicio de CS (Valor previo) y durante una ventana de 200 ms antes del inicio de EE. UU. (Valor CR). El valor CR fue diseñado para capturar las respuestas de parpadeo adaptativo que ocurren inmediatamente antes del inicio de la ecografía. Una prueba se definió como una prueba de CR si el valor de CR era al menos cinco veces mayor que el del valor previo. Los ensayos en los que el Pre-Valor superó el 30 % del umbral se clasificaron como ensayos "hiperactivos" y se descartaron. El porcentaje de respuestas condicionadas (%CR) en cada tipo de ensayo fue el número de ensayos CR para ese tipo de ensayo, dividido por el número total de ensayos válidos para ese tipo. El porcentaje de ensayos hiperactivos se calculó dividiendo el número total de ensayos clasificados como hiperactivos por el número total de ensayos (Experimento 1: # hiperactivo/100, Experimento 2: # hiperactivo/150). Para representar visualmente el patrón temporal de la actividad EMG en días específicos, primero se normalizó la amplitud EMG a través de la división con el valor previo en cada ensayo. A continuación, se promedió la amplitud de EMG normalizada para ese ensayo entre todos los ensayos válidos del mismo tipo de ensayo en cada rata y luego entre ratas para días específicos. Para el Experimento 1, examinamos el patrón temporal de la actividad EMG calculando la latencia hasta el inicio de la CR, así como la latencia hasta el pico de la CR en cada rata durante la última sesión. Solo los ensayos en los que la rata mostró RC se utilizaron para el análisis de latencia. De cada ensayo se extrajo la primera amplitud de EMG en una ventana de 1,3 s a partir de 300 ms antes del inicio del SC. Luego, los valores de EMG se restaron por el valor previo (EMG-Pre) y los primeros 300 ms de datos se promediaron y multiplicaron por cinco para generar el valor de umbral de CR. A continuación, se definió la latencia hasta el inicio de la CR como el primer punto temporal en una ventana de 500 ms después de la terminación de la CS en la que el valor de EMG-Pre excedía el valor del umbral de CR. La latencia hasta el pico de CR se definió como el punto de tiempo durante la misma ventana de 500 ms en la que el valor de EMG-Pre fue el más alto. Finalmente, las latencias de inicio y pico en cada prueba se promediaron en todas las pruebas del mismo tipo en cada rata.

Las ratas recibieron infusiones intracraneales de sus soluciones asignadas a partir del segundo día de habituación y durante los 10 días de DTEBC1. A las ratas sujetas en un cono de plástico flexible se les infundió 20 minutos antes del inicio del acondicionamiento. La infusión consistió en una solución de bromhidrato de muscimol (0,5 mg en 0,5 ml de líquido cefalorraquídeo artificial [aCSF], G019 Sigma-Aldrich) o aCSF. Se infundió un total de 500 nl en el transcurso de un minuto. Posteriormente, la cánula de infusión se dejó colocada durante un minuto adicional antes de la extracción. La concentración del fármaco, los volúmenes de infusión y la velocidad de infusión se eligieron en base a nuestros estudios previos, que encontraron que la propagación del muscimol se limitaba a un rango máximo de 1 mm desde la punta de la cánula47,48. El grupo de muscimol totalizó ocho ratas mientras que el grupo de control aCSF totalizó nueve.

Las grabaciones fotométricas de las terminales prefrontales dentro del RE y MD se realizaron midiendo la fluorescencia a granel a través de una sola fibra óptica a través de la cual se entregó la luz excitatoria y se capturó la fluorescencia emitida. Se utilizó un LED de 465 nm modulado a 381 Hz para estimular GCaMP6f., emitiendo una fluorescencia dependiente de calcio. Se utilizó un LED de 405 nm modulado a 221 Hz para estimular GCaMP6f. en su longitud de onda isosbéstica de excitación, emitiendo una fluorescencia independiente del calcio. La modulación se realizó a través de un sistema de grabación RZ5 (Tucker Davis Technologies). La luz de ambos LED se acopló a un minicubo de fluorescencia integrado (IFMC, Doric Lenses) que generaba ambos flujos de luz en un cable de conexión de fibra acoplado (NA 0,48, tamaño de núcleo de 400 µm, Doric Lenses). A continuación, el cable de conexión se acopló con el conjunto de férula y fibra óptica implantada utilizando un manguito de zirconio opaco (Thorlabs). La potencia de salida de ambos LED medidos en la punta del latiguillo fue de 60 µW (PM100D, Thorlabs). La fluorescencia emitida por el animal pasó a través del latiguillo y entró en el IFMC que estaba acoplado a un fotorreceptor de femtovatios (Doric Lenses). Luego, la salida del fotorreceptor se introdujo en el sistema de grabación RZ5, que demoduló y muestreó la salida a 1 kHz. Las grabaciones fotométricas se realizaron los días dos a 13 en el Experimento 2. Debido a que cada sesión duró 75 minutos, solo encendimos los LED durante un breve período de tiempo bloqueado en los estímulos para minimizar el fotoblanqueo dentro de cada sesión. El día dos (Hab 2) los LED se encendieron durante nueve segundos cada 30 s. En el día tres (Sesión 0), los LED se encendieron cuatro segundos antes del inicio de TS, LS y US, y se dejaron encendidos durante nueve segundos en cada ensayo. En los días cuatro a 13 (sesiones uno a 10), los LED se encendieron cuatro segundos antes del inicio de la EC y se dejaron encendidos durante un total de nueve segundos en cada ensayo. En las dos primeras ratas condicionadas, se detectó una pequeña cantidad de artefacto en el suministro de ultrasonido durante la sesión 0, este artefacto no se observó para el TS ni para el LS. Congruente con los análisis posteriores de las respuestas terminales hacia el CS, elegimos analizar solo la actividad evocada por el TS y el LS en la Sesión 0.

Se usó la actividad de fluorescencia del código MATLAB escrito personalizado de la estimulación de 405 nm para corregir el artefacto de movimiento y el fotoblanqueo. En primer lugar, debido a que la salida fluorescente se estabilizó en dos segundos desde el inicio del LED, las señales de 465 nm y 405 nm de los últimos siete segundos del LED de nueve segundos a tiempo se extrajeron de cada prueba. Luego, la señal de 405 nm se ajustó a la señal de 465 nm utilizando un enfoque de ajuste lineal de mínimos cuadrados, luego se calculó el ΔF/F como: (señal de 465 nm - señal de 405 nm ajustada)/señal de 405 nm ajustada. Los valores de ΔF/F resultantes representaron la actividad del calcio dos segundos antes y cinco segundos después del inicio del CS en cada prueba. Los valores de ΔF/F luego se promediaron en todas las pruebas que compartían el mismo tipo de prueba para esa sesión.

Para representar la actividad de calcio provocada por CS en terminales prefrontales dentro del RE o MD, los valores de ΔF/F en una ventana de seis segundos a partir de dos segundos antes del inicio de CS se agruparon por primera vez según el tipo de prueba, luego se promediaron los valores entre las pruebas en cada sesión. Para la comparación de las respuestas de ΔF/F a diferentes tipos de CS, los valores del área bajo la curva (AUC) se calcularon sumando los valores de ΔF/F promediados del ensayo en una ventana de dos segundos para cada sesión en cada rata. Para el AUC de línea de base, la ventana comenzó dos segundos antes del inicio del CS, mientras que para el AUC de respuesta de CS, la ventana comenzó desde la terminación del CS. A continuación, se promediaron los valores de AUC entre las ratas en cada sesión.

Una vez que concluyeron las pruebas de comportamiento, las ratas se anestesiaron profundamente con una cantidad excesiva de pentobarbital sódico (80 mg/kg, Bimeda). Primero fueron perfundidos transcardiacamente con solución salina fisiológica al 0,9% fría, seguida de paraformaldehído al 4% (PFA) fría. Se extrajeron los cerebros y se sumergieron en PFA al 4 % a 4 °C durante dos horas, seguido de inmersión en solución salina tamponada con fosfato y sacarosa al 30 % (PBS-Suc) durante 48 h. Se recolectaron cortes coronales de cerebro (45 μm) en toda la extensión anteroposterior de mPFC, RE y MD usando un criostato (CM3050S, Leica Biosystems). Las secciones de tejido se almacenaron en tubos llenos de tampón de almacenamiento de tejido (PBS-Suc y solución de etilenglicol), luego todos los tubos se almacenaron a -20 °C. Para localizar las ubicaciones de las cánulas de infusión, el tejido se montó en un portaobjetos de vidrio y se tiñó con violeta de cresilo. Se aplicó una capa delgada de solución de montaje Cytoseal 280 (n.º 8311–4, Thermo Fisher Scientific) junto con un cubreobjetos de vidrio. Los portaobjetos se observaron bajo un microscopio óptico (Leica DM400b). Para ubicar las ubicaciones de fibra óptica, el tejido se montó en un portaobjetos de vidrio y luego se selló con Cytoseal y un cubreobjetos de vidrio. Los portaobjetos se observaron bajo un microscopio fluorescente vertical (Zeiss AxioImager 2.0). A continuación, se dibujaron las ubicaciones de las cánulas y las fibras ópticas en placas del atlas estereotáxico del cerebro de rata49. En el Experimento 1, solo se usaron aquellas ratas con una cánula dirigida con precisión al RE, y solo aquellas ratas con una fibra óptica dirigida con precisión al RE o MD en el Experimento 2.

El tamaño de la muestra para el Experimento 1 (inactivación farmacológica del RE) se basó en nuestros estudios conductuales previos utilizando TEBC7,16,17. De manera similar, el tamaño de la muestra para el Experimento 2 (fotometría) se basó en el tamaño de la muestra utilizado para informar datos de potencial de campo local en nuestros artículos anteriores16,17,18. Los datos se presentaron como la media del grupo ± error estándar de la media (SEM). Los análisis estadísticos se realizaron con MATLAB y el software estadístico SPSS (IBM). Para determinar la significación estadística, utilizamos: análisis de varianza (ANOVA) de medidas repetidas de una vía, ANOVA mixto/medidas repetidas de dos vías, ANOVA mixto de tres vías, prueba t de una muestra, pruebas t pareadas y no pareadas, prueba t lineal análisis de regresión y correlación de Pearson. La significancia se definió como *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Primero, buscamos confirmar que el RE era necesario para la formación de asociaciones de estímulo en DTEBC al examinar el impacto de la inactivación farmacológica del RE en la adquisición de CR. Después de dos días de sesiones de habituación, 22 ratas se sometieron a 10 sesiones de adquisición, durante las cuales el estímulo de tono se emparejó con el US (TCS+), mientras que el estímulo de luz (LCS-) se presentó solo (Fig. 1a). Antes de cada sesión de adquisición, se infundió el agonista del receptor GABAA muscimol (Fig. 1b) en el RE de 11 ratas (grupo muscimol), mientras que las otras 11 recibieron infusiones de líquido cefalorraquídeo artificial (grupo control). Se retiraron cinco ratas debido a una cánula mal dirigida, dejando ocho ratas en el grupo de muscimol y nueve ratas en el grupo de control (Fig. 1c). Durante 10 sesiones de acondicionamiento, el grupo de control aumentó gradualmente la proporción de pruebas de TCS+ en las que expresaron RC (Fig. 1d). En comparación con los controles, el grupo de muscimol expresó RC en un número menor de ensayos de TCS+ (Fig. 1d, ANOVA mixto de tres vías, interacción Sesión × Grupo × Tipo de CS, F(9,135) = 2,299, p = 0,020. Seguimiento de dos ANOVA mixto para ensayos TCS+, sesión, F(9135) = 21,037, p < 0,001; grupo, F(1,15) = 8,266, p = 0,012; sesión × interacción grupal, F(9135) = 3,264, p = 0,001 ). Específicamente, el grupo de muscimol expresó números significativamente más bajos de RC en la sesión siete (pruebas t no pareadas corregidas para comparaciones múltiples, t15 = 4,026, p = 0,001), mientras que hubo una tendencia a una expresión de RC más baja en las sesiones cinco a seis y ocho a 10. (p = 0,005-0,054). Paralelamente, ambos grupos mostraron un pequeño aumento en el número de RC expresadas en ensayos LCS; sin embargo, la frecuencia de expresión de RC fue mayor en el grupo de muscimol que en el de control (seguimiento ANOVA mixto bidireccional para ensayos de LCS, Sesión, F(9,135) = 2,362, p = 0,016; Grupo, F(1,15) = 5,063, p = 0,040, sesión × interacción grupal, F(9,135) = 0,930, p = 0,502). Además, durante los últimos tres días, ambos grupos mostraron un RC% más alto en TCS+ en comparación con los ensayos LCS- (ANOVA mixto bidireccional sobre el CR% promediado en los últimos tres días, interacción Grupo × Tipo CS, F(1,15 ) = 8.732, p = 0.010; Tipo CS, F(1,15) = 85.170, p < 0.001; Grupo, F(1,15) = 4.845, p = 0.044). Las pruebas t no pareadas de seguimiento corregidas para comparaciones múltiples revelaron que el grupo de muscimol tenía un porcentaje de RC significativamente menor en los ensayos con TCS+ en comparación con los controles (t15 = 2,665, p = 0,018), mientras que el porcentaje de RC en los ensayos con LCS- era comparable entre grupos (t15 = − 1,421, p = 0,176). Además, el grupo de muscimol no difirió del grupo de control en términos de la cantidad de ensayos durante los cuales mostraron saltos, encabritamiento o acicalamiento inmediatamente antes del inicio de la EC (Fig. 1e, ANOVA mixto bidireccional, interacción Sesión × Grupo, F (9135) = 1,144, p = 0,336; Sesión, F (9135) = 1,765, p = 0,081; Grupo, F (1,15) = 0,539, p = 0,474), lo que indica que la inhibición de RE no afectó los niveles de actividad de referencia. Estos hallazgos sugieren que la inhibición de RE perjudicó la capacidad de las ratas para formar asociaciones de estímulo; sin embargo, su capacidad para discriminar el tono de los estímulos luminosos no se vio afectada.

La inactivación reversible del RE perjudica el aprendizaje asociativo diferencial pero no la discriminación de estímulos. (a) Paradigma conductual. Los dos tipos de ensayos se mezclaron aleatoriamente y se presentaron en sesiones de 50 min. (b) Las respuestas condicionadas (CR) se detectaron registrando la actividad del electromiograma (EMG) del músculo orbicular de los párpados izquierdo. Se implantó una cánula de microinfusión dirigida al OD. ( c ) Tres a la izquierda: reconstrucción histológica de las ubicaciones de la punta de la cánula en el RE para todas las ratas incluidas en los análisis finales. Las barras negras y rojas indican la posición de la cánula de infusión para los grupos de control (N = 9) y muscimol (N = 8), respectivamente. La numeración en la parte superior indica las coordenadas anterior-posterior (AP) de bregma. Derecha: sección representativa en el RE. ( d ) Proporción de ensayos en los que las ratas expresaron el CR al TCS + y LCS- (* p <0.05, interacción Grupo × Tipo CS). Las barras de error indican ± error estándar de la media (SEM). ( e ) Porcentaje de ensayos hiperactivos (media ± SEM). (f) Amplitud EMG normalizada promedio en la sesión 10. Los rectángulos azules y verdes indican la presentación TCS+ y LCS-, respectivamente. Un rectángulo negro indica la presentación en EE.UU. Las áreas sombreadas indican ± SEM.

Para examinar si la inhibición de RE impactó el patrón temporal de la respuesta de parpadeo condicionado, representamos el CR integrado promedio para ambos grupos y tipos de CS en la última sesión (Fig. 1f). En comparación con el grupo de control, la amplitud de EMG promediada en los ensayos de TCS+ fue menor en el grupo de muscimol, lo que confirma aún más el número reducido de CR expresadas (Fig. 1f superior). Sin embargo, los patrones temporales de la amplitud EMG promediada fueron comparables entre los dos grupos. No se encontraron diferencias entre los grupos en cuanto a su latencia al inicio de la RC (grupo control: 238 ± 36 ms; grupo muscimol: 226 ± 41 ms; prueba t no pareada, t15 = 0,225, p = 0,825), ni la latencia a la pico (grupo control: 448 ± 10 ms; grupo muscimol: 411 ± 17 ms; t15 = 1,917, p = 0,074). Del mismo modo, en los ensayos LCS-, no se encontraron diferencias entre los grupos en cuanto a su latencia al inicio (grupo control: 192 ± 39 ms; grupo muscimol: 241 ± 57 ms; t15 = − 0,723, p = 0,481), ni latencia al pico (grupo control: 434 ± 17 ms; grupo muscimol: 416 ± 23 ms; t15 = 0,674, p = 0,510). Por lo tanto, aunque la inhibición de RE redujo el número de CR expresados, no afectó el patrón temporal general de las CR.

Habiendo establecido que la integridad del RE es necesaria para la formación de la asociación de estímulos, investigamos cómo las terminales prefrontales dentro del RE y MD respondieron a los estímulos cuando las ratas los asociaron con el shock del párpado. Con este fin, infundimos bilateralmente un vector viral en el mPFC para expresar el indicador de calcio codificado genéticamente (GCaMP6f.) dentro de las neuronas del mPFC (Fig. 2a). La actividad de sus terminales dentro del RE o MD fue monitoreada a través de una fibra óptica implantada crónicamente en el RE o MD (nueve ratas para cada región). Expresión de GCaMP6f. se localizó en la región prelímbica (PrL) de la mPFC en ambos hemisferios, con una expresión mínima dentro de las cortezas cingulada anterior (ACC) e infralímbica vecinas (IL, Fig. 2b). De las 18 ratas, se eliminaron cuatro ratas debido a fibras ópticas mal dirigidas, y se eliminó una rata debido a la rotura del núcleo interno de la fibra durante el condicionamiento conductual. Esto dejó un total de seis ratas con fibras ópticas dirigidas a terminales dentro del RE (grupo RE) y siete ratas con fibras dirigidas al MD (grupo MD, Fig. 2c). Por lo tanto, todos los análisis posteriores en el Experimento 2 se realizaron solo en estas ratas. Confirmamos que la señal dependiente de calcio de 465 nm era marcadamente diferente de la señal independiente de calcio de 405 nm (Fig. 2d). Los valores de ΔF/F calculados a partir de estas dos señales nos permitieron examinar los transitorios de calcio menos cualquier contaminación por fotoblanqueo o artefactos de movimiento (ver Métodos).

Las terminales prefrontales dentro del RE no se activan mediante señales sensoriales que carecen de cualidades mnemotécnicas. (a) Terminales prefrontales (región prelímbica [PrL]) que expresan GCaMP6f. fueron grabados dentro del RE o MD. ( b ) Reconstrucción histológica y sección representativa de la mPFC que muestra GCaMP6f. expresión (verde). Las infusiones virales fueron bilaterales; los hemisferios se superpusieron para mostrar la dispersión en ambos hemisferios. La numeración indica la coordenada AP de bregma. Abreviaturas: corteza cingulada anterior (ACC), corteza infralímbica (IL). (c) Arriba: reconstrucción histológica de colocación de punta de fibra óptica en OD y MD. Abajo: secciones representativas dentro del área ampliada. La numeración indica la coordenada AP de bregma. ( d ) Señales representativas dependientes de calcio (465 nm) e independientes (405 nm) del registro fotométrico de terminales prefrontales dentro del MD en una rata representativa durante la presentación del tono. Dos líneas verticales indican el inicio y la terminación del tono. Las líneas discontinuas indican ± SEM (N = 25 presentaciones). ( e ) Respuestas terminales prefrontales a estímulos en la Sesión 0 promediadas entre ratas. Las áreas sombreadas indican ± SEM (RE, N = 6 ratas; MD, N = 7 ratas). (f) Línea de base de la sesión 0 y AUC evocada de CS calculada mediante la suma de los valores de ΔF/F en una ventana de dos segundos inmediatamente antes y después de las presentaciones de CS, respectivamente (*p < 0,05, frente a la línea de base). Las barras de error indican ± SEM (RE, N = 6 ratas; MD, N = 7 ratas).

Primero investigamos las respuestas terminales a dos estímulos sensoriales neutrales antes del condicionamiento. Después de dos días de sesiones de habituación, las ratas se sometieron a una sesión de prueba de estímulo de preacondicionamiento (Sesión 0), que implicó pruebas en las que se presentó solo un estímulo de tono (TS) o luz (LS). Durante la Sesión 0, las presentaciones tanto del TS como del LS provocaron respuestas fuertes y claramente definidas de las terminales prefrontales dentro del MD, mientras que las respuestas terminales en el RE fueron débiles y más difíciles de distinguir de la actividad inicial (Fig. 2e). Para cuantificar si estas respuestas fueron significativamente mayores que la actividad de referencia, calculamos el área bajo la curva (AUC) para nuestros valores de ΔF/F durante una ventana de dos segundos antes y después del inicio de CS. Descubrimos que, en comparación con la actividad inicial, las terminales dentro del RE no se activaron significativamente por las presentaciones de TS o LS (Fig. 2f izquierda, medidas repetidas bidireccionales [RM] ANOVA, Interacción de período de tiempo × tipo CS, F( 1,5) = 0,391, p = 0,559; Periodo de tiempo, F(1,5) = 1,700, p = 0,249; Tipo CS, F(1,5) = 0,112, p = 0,751). Por el contrario, los terminales dentro del MD fueron fuertemente activados por ambos estímulos (Fig. 2f derecha, ANOVA de RM bidireccional, Interacción de período de tiempo × tipo de CS, F (1,6) = 1.112, p = 0.332; Período de tiempo, F (1 ,6) = 10,061, p = 0,019, tipo CS, F(1,6) = 0,125, p = 0,736). Estos hallazgos sugieren que los nuevos estímulos sensoriales en ausencia de cualidades mnemotécnicas activan fuertemente las terminales prefrontales dentro del MD pero no del RE.

Después de la Sesión 0, las ratas se acondicionaron durante 10 días en DTEBC2 (Fig. 3a). El tono se utilizó como CS+ para 10 ratas, cinco de las cuales tenían una fibra óptica dirigida al RE y las otras cinco al MD. La luz se utilizó como CS+ en el restante y dos ratas con fibra óptica en el RE y MD, respectivamente. Durante 10 sesiones de acondicionamiento, las 13 ratas aumentaron gradualmente la proporción de ensayos CS+US y CS+ en los que expresaron RC. Mientras que el número de CR en los ensayos de CS se mantuvo bajo (Fig. 3b, ANOVA de RM de dos vías, interacción Sesión × Tipo de CS, F(18,216) = 18,418, p < 0,001; Sesión, F(9,108) = 36,220, p < 0,001; Tipo CS, F(2, 24) = 72,052, p < 0,001). Durante los últimos tres días, el % CR fue significativamente mayor en las pruebas CS+US y CS+ en comparación con las pruebas CS- (ANOVA de RM unidireccional sobre el % CR promedio en los últimos tres días, Tipo CS, F(2,24) = 185,663, p < 0,001. Prueba t pareada corregida para comparaciones múltiples CS- vs., CS+US: t12 = 16,541, p < 0,001; CS+ : t12 = 13,524, p < 0,001). No hubo diferencia en RC% entre los ensayos CS+US y CS+ (prueba t pareada corregida para comparaciones múltiples, t12 = 0,385, p = 0,707). La inspección del CR integrado promediado para el último día de acondicionamiento reveló patrones temporales de respuesta de parpadeo similares a los del Experimento 1 (Fig. 3c).

Comportamiento durante el registro de fotometría. (a) Paradigma conductual. Los tres tipos de ensayos se mezclaron aleatoriamente y se presentaron en sesiones de 75 min. (b) Proporción de ensayos en los que las ratas (N = 13) expresaron el CR en cada uno de los tres tipos de ensayos (*p < 0,05, interacción Sesión × Tipo CS). Las barras de error indican ± SEM. ( c ) Amplitud EMG normalizada promedio en la sesión 10. El rectángulo gris indica la presentación CS. La región de alta amplitud del trazo rosa (CS+US) representa el artefacto causado por la entrega de los US. Las áreas sombreadas indican ± SEM.

Durante las sesiones diarias de acondicionamiento, registramos la actividad de calcio de las terminales prefrontales dentro del RE (Fig. 4a) de seis ratas. Descubrimos que los terminales dentro del RE respondieron al CS + y al CS- en una magnitud similar en las primeras sesiones (Fig. 4b, c). A medida que progresó el condicionamiento, el CS+ evocó gradualmente respuestas más fuertes; mientras que las respuestas al CS- se debilitaron y luego se mantuvieron bajas en todo momento. Para cuantificar mejor el cambio en la respuesta a lo largo de los días, calculamos el AUC sumando los valores de ΔF/F durante una ventana de dos segundos justo después de la terminación de CS. Descubrimos que la respuesta evocada de CS+ fue significativamente mayor que la de CS- (Fig. 4d, ANOVA de RM bidireccional, interacción Sesión × Tipo de CS, F(9,45) = 2,839, p = 0,010; Sesión, F(9, 45) = 0,695, p = 0,709; Tipo CS, F(1,5) = 47,743, p = 0,001). Los análisis de regresión lineal de seguimiento revelaron que las respuestas provocadas por CS+ crecieron en magnitud a lo largo de los días de acondicionamiento en cinco de seis ratas RE (cinco ratas p < 0,05, una rata p = 0,411), por el contrario, no se observaron efectos significativos para CS- respuestas evocadas (seis ratas p > 0,05).

La magnitud de la actividad evocada de CS+ en las terminales prefrontales dentro del RE aumenta en paralelo con la formación de la asociación de estímulos. (a) Terminales prefrontales (región prelímbica [PrL]) que expresan GCaMP6f. se registraron dentro del RE. (b) Izquierda: valores de ΔF/F promediados durante los primeros tres días de acondicionamiento. Derecha: igual que la izquierda pero para los últimos tres días de acondicionamiento. Las líneas negras verticales representan el inicio y la terminación del CS. Las áreas sombreadas indican ± SEM. (c) Izquierda: valores promedio de ΔF/F de las terminales prefrontales dentro del RE en respuesta al CS+ a lo largo de los días de condicionamiento (eje y, descendiendo de arriba a abajo), graficados contra el tiempo (eje x). Las líneas blancas verticales representan el inicio y la terminación del CS+. Derecha: igual que la izquierda pero para el CS-. ( d ) AUC promedio en una ventana de dos segundos inmediatamente después de la presentación de CS graficada contra días de condicionamiento (* p < 0.05, interacción Sesión × Tipo de CS). Las barras de error indican ± SEM.

En una cohorte separada de siete ratas, registramos la actividad de calcio de las terminales prefrontales dentro del MD durante las sesiones de acondicionamiento diarias (Fig. 5a). Los terminales prefrontales dentro del MD mostraron respuestas más fuertes al CS + que al CS- a partir de la primera sesión (Fig. 5b, c). La diferencia en la magnitud de la respuesta entre CS+ y CS- apareció más marcada en sesiones posteriores, principalmente debido al aumento de las respuestas a CS+. Sin embargo, estas impresiones visuales no fueron confirmadas por el análisis estadístico aplicado a los valores de AUC (Fig. 5d, ANOVA RM bidireccional, interacción Sesión × Tipo CS, F(9,54) = 0,869, p = 0,586; Sesión, F (9,54) = 1,530, p = 0,161, tipo CS, F(1,6) = 9,000, p = 0,024). Nuestros hallazgos sugieren que aunque el CS+ evocó una mayor salida prefrontal tanto en el RE como en el MD, en comparación con el CS-, la evolución de esta salida difirió entre las dos regiones del cerebro. Principalmente, la salida prefrontal al RE se fortaleció a lo largo de los días de acondicionamiento, mientras que la salida al MD se hizo más fuerte para el CS+ en el primer día de acondicionamiento y se mantuvo estable en los días posteriores.

El CS+ evocó mayor actividad en terminales prefrontales dentro del MD en comparación con el CS- a partir de la primera sesión de condicionamiento. ( a ) Terminales prefrontales (región PrL) que expresan GCaMP6f. fueron grabados dentro del MD. (b) Izquierda: valores de ΔF/F promediados durante los primeros tres días de acondicionamiento. Derecha: igual que la izquierda pero para los últimos tres días de acondicionamiento. Las líneas negras verticales representan el inicio y la terminación del CS. Las áreas sombreadas indican ± SEM. (c) Izquierda: valores promedio de ΔF/F de las terminales prefrontales dentro del MD en respuesta al CS+ a lo largo de los días de condicionamiento (eje y, descendiendo de arriba a abajo), representados frente al tiempo (eje x). Las líneas blancas verticales representan el inicio y la terminación del CS+. Derecha: igual que la izquierda pero para el CS-. (d) AUC promediada en una ventana de dos segundos inmediatamente después de la presentación de CS graficada frente a los días de acondicionamiento (*p < 0,05, efecto principal del tipo de CS). Las barras de error indican ± SEM.

Para comparar las diferencias más directamente entre la salida prefrontal al RE y MD, dividimos el AUC provocado por el estímulo promediado en los últimos tres días de condicionamiento con el AUC provocado por el estímulo antes del condicionamiento (Sesión 0). Este AUC normalizado cuantificó el cambio relativo de la actividad terminal provocada por CS antes y después del aprendizaje asociativo. El cambio en la respuesta evocada CS+ fue significativamente mayor en los terminales dentro del RE que en los del MD (Fig. 6a, ANOVA mixto bidireccional, interacción Grupo × Tipo CS, F(1,11) = 4,942, p = 0,048; Grupo, F(1,11) = 2,297, p = 0,158 Tipo CS, F(1,11) = 10,508, p = 0,008 Prueba t no pareada de seguimiento, t11 = 2,320, p = 0,041). Por el contrario, el cambio en las respuestas provocadas por CS fue comparable entre los terminales dentro del RE y MD (t11 = 0,535, p = 0,603). Estos hallazgos sugieren que la formación de asociaciones de estímulo resultó en un mayor aumento de la salida prefrontal hacia el RE que hacia el MD.

La formación de la asociación CS+US va acompañada de un mayor aumento de la actividad evocada CS+ en las terminales prefrontales dentro del RE en comparación con el MD. ( a ) Comparación de CS + y CS- evocado AUC entre terminales prefrontales dentro de RE (N = 6) y MD (N = 7, * p <0.05). Se promedió el AUC durante los últimos tres días de acondicionamiento y se normalizó utilizando los valores de AUC evocados por CS de la Sesión 0. Las barras de error indican ± SEM. ( b ) Correlaciones de RC% con CS evocado AUC en dos ratas representativas. Los puntos dentro de cada gráfico representan el % de CR para los ensayos CS+ o CS- trazados frente al valor de AUC para el mismo tipo de ensayo en las 10 sesiones. Arriba: rata de fibra RE. Abajo: rata fibra MD (*p < 0,05). (e) Comparación de coeficientes de correlación promediados entre CR% y AUC (RE, N = 6; MD, N = 7). Las barras de error indican ± SEM.

Para estrechar aún más la relación entre las salidas talámicas prefrontales y el aprendizaje asociativo, calculamos el coeficiente de correlación de Pearson (r) entre los valores de AUC y CR% para ambos tipos de CS en las 10 sesiones de acondicionamiento. De las seis ratas RE, tres mostraron una correlación positiva significativa (p < 0,05) entre la magnitud de la respuesta y el % CR (Fig. 6b). De las siete ratas MD, tres mostraron una correlación positiva significativa. Como grupo (Fig. 6c), los valores R fueron significativamente diferentes de cero en los grupos RE (prueba t de una muestra, t5 = 3.720, p = 0.014) y MD (t6 = 9.056, p = 0.001). Los valores R también fueron comparables entre los grupos RE y MD (prueba t no pareada, t11 = 0,713, p = 0,491). Por lo tanto, las salidas prefrontales al RE y al MD fueron selectivas para las asociaciones de estímulo; sin embargo, solo las salidas prefrontales al RE mostraron una mayor mejora en la selectividad asociativa con el aprendizaje.

La evidencia acumulada de los estudios de comportamiento ha demostrado que el RE, en particular la vía mPFC-a-RE, juega un papel importante en los procesos de formación de la memoria que se basan en una comunicación estrecha entre el mPFC y el HPC22,23,24. Sin embargo, estudios previos no investigaron el grado en que las salidas de mPFC al RE están moduladas por las características sensoriales y relacionales de los estímulos de la tarea. Al monitorear la actividad de las proyecciones prefrontales que terminan en el RE, encontramos que la actividad terminal prefrontal se activó fuertemente por un estímulo solo después de que el estímulo se asoció con un resultado aversivo. La magnitud de la actividad terminal provocada por el estímulo se correlacionó positivamente con la fuerza de la asociación del estímulo aprendido. Además, el aumento relacionado con el aprendizaje en las respuestas terminales fue mayor en el RE que en otro objetivo de salida talámico, el MD. Esto destaca el papel único de la vía mPFC-to-RE en el enrutamiento de información relacionada con la relevancia conductual de los estímulos sensoriales durante el aprendizaje asociativo.

Nuestras grabaciones fotométricas demostraron que las terminales prefrontales dentro del RE no se activaron en respuesta a los estímulos auditivos y visuales que se presentaron por sí mismos (Sesión 0; Fig. 2e, f). Sin embargo, con el aprendizaje, se activaron fuertemente por uno de los estímulos que se emparejaron con una descarga en el párpado, pero no por el otro estímulo presentado solo (Fig. 4d). Estos hallazgos sugieren que el cambio detectado en la salida de mPFC-a-RE es atribuible al aprendizaje asociativo, pero no a la sensibilización a estímulos sensoriales presentados repetidamente. Se informaron previamente patrones de actividad diferencial similares para la actividad oscilatoria17,18 y en picos de mPFC12,14,15,50,51. Además, una manipulación que potencie esta actividad diferencial facilita la formación de asociaciones de estímulos16,17. En conjunto, estos hallazgos sugieren que la mPFC desempeña un papel fundamental en la detección y codificación de asociaciones de estímulos relevantes52. Los hallazgos presentes amplían esta noción al demostrar que la relevancia detectada se enruta al RE.

Cuando el RE se inactivó farmacológicamente, las ratas no pudieron formar la asociación entre el estímulo y el resultado aversivo, pero no aumentaron sus respuestas al otro estímulo presentado solo (Fig. 1d). Estos patrones indican que el RE es necesario para la formación de asociaciones de estímulos, pero no para la discriminación sensorial. La presente observación es consistente con informes previos de que la perturbación de RE a través de muscimol53 o estimulación eléctrica de alta frecuencia40 perjudicó la adquisición de memoria en rastros de miedo y rastros de condicionamiento de parpadeo, respectivamente. Al mismo tiempo, incluso con la inactivación de RE, las ratas aún mostraban un pequeño grado de aprendizaje asociativo. Es probable que esto sea el resultado de una inactivación incompleta del RE, ya que el RE se extiende mucho más allá del eje anteroposterior, que está más allá de la propagación de nuestro muscimol infundido.

Dada la selectividad de las proyecciones prefrontales en el RE para la relevancia conductual de los eventos sensoriales, los déficits de aprendizaje observados después de la inhibición del RE podrían deberse a la privación del HPC de la señal de relevancia del mPFC. Alternativamente, la inhibición de RE también podría interrumpir la sincronización de la actividad neuronal entre mPFC y HPC, que se sabe que desempeña un papel esencial en el aprendizaje asociativo temporal19,54. En ratas anestesiadas con uretano, la inactivación de RE interrumpió tanto el patrón temporal del estallido gamma (GB) como su sincronicidad entre mPFC y CA1; sin embargo, la frecuencia de estas ocurrencias de GB en ambas regiones no se vio afectada30. Más recientemente, hemos encontrado que la tasa de incidencia de mPFC GB durante los intervalos de seguimiento en DTEBC se correlacionó positivamente con la adquisición de tareas18. Si GB similar también ocurre en CA1 al mismo tiempo, la inhibición de RE podría interrumpir su sincronía, lo que provocaría una interrupción en la comunicación mPFC-HPC. Además, como no inhibimos selectivamente las proyecciones de mPFC a RE, el aprendizaje deficiente con la inhibición de RE puede deberse a la interrupción de la transferencia de información y/o efectos moduladores del HPC dorsal a mPFC a través del RE.

Paralelamente a su papel en el acceso a la información, varios trabajos que utilizan tareas de condicionamiento contextual del miedo argumentaron que el RE también controla la precisión de los recuerdos contextuales del miedo35,36,37,38. Específicamente, la inactivación de la salida de mPFC al RE o el silenciamiento directo de las proyecciones del RE llevaron a la adquisición de una memoria de miedo que carecía de selectividad para el contexto de condicionamiento original35. En particular, los recuerdos contextuales imprecisos adquiridos durante períodos en los que el ER estaba inactivo se adquieren independientemente del hipocampo36. En el condicionamiento del miedo contextual, los sujetos con una función hipocampal reducida forman una asociación elemental del choque de pies con una señal ambiental simple, pero no con representaciones detalladas del entorno condicionante, lo que resulta en la pérdida de la especificidad del contexto55,56. Por lo tanto, el papel aparente de RE en el control de la precisión de la memoria puede ser una manifestación de su papel más general en la modulación de la participación del HPC en la codificación de la memoria36. Esta idea encaja bien con los déficits de aprendizaje observados en nuestra tarea. Específicamente, en TEBC, el HPC es necesario para cerrar la brecha temporal entre CS y US, que no se puede eludir mediante la participación de una estrategia de aprendizaje de bajo nivel1,2,3. Por lo tanto, la inhibición de RE resultó en una adquisición deficiente de CR (Fig. 1d) porque no pudo comprometerse adecuadamente con el HPC durante el condicionamiento. Nuestros datos de fotometría ampliaron aún más esta idea al sugerir que esta funcionalidad del RE está controlada por la salida de mPFC que señala la relevancia de los eventos en curso.

El MD está recíprocamente conectado con el mPFC41,42,43 pero carece de proyecciones hacia y desde el HPC44,45. Esta característica anatómica nos llevó a contrastar las salidas prefrontales entre MD y RE, descubriendo varias cualidades exclusivas de las proyecciones de mPFC en MD. Primero, las terminales prefrontales en el DM fueron fuertemente activadas por estímulos sensoriales antes de que comenzara el condicionamiento. En segundo lugar, una vez que comenzó el condicionamiento, las salidas prefrontales al MD diferenciaron entre CS + y CS- antes de que las ratas desarrollaran RC diferenciales (Fig. 3b y 5d). Además, la magnitud de la respuesta no aumentó en las sesiones de acondicionamiento posteriores. Con base en estos hallazgos, argumentamos que el bucle entre mPFC y MD ayuda a mantener las representaciones de estímulo dentro de mPFC durante los intervalos de estímulo-resultado, como se propone en varias formas de tareas de memoria de trabajo45,57,58,59,60,61,62. Por ejemplo, los terminales MD dentro de la mPFC son necesarios para la activación sostenida de las neuronas de la mPFC durante el período de retraso de una tarea de laberinto en T de muestra no coincidente retrasada57. Además, en otra tarea de WM que requería el mantenimiento de una señal sensorial durante un período de retraso para una selección de elección basada en reglas posterior, se descubrió que la actividad de DM del período de retraso dependía de las entradas de las neuronas mPFC selectivas de señal58,61. Estos estudios destacan la importancia de las proyecciones MD para el mPFC en el mantenimiento de la información conductualmente relevante y la dependencia del MD del estímulo evocado en la salida del mPFC para iniciar este proceso. En base a esto, los estímulos novedosos o posiblemente relevantes deberían provocar la salida de mPFC al MD, ya que el animal necesitaría mantener el estímulo en un estado activo para evaluar si es lo suficientemente relevante desde el punto de vista del comportamiento para garantizar su compromiso con la memoria. Este punto de vista también corrobora los hallazgos de estudios en los que los conejos con lesiones MD requirieron un mayor número de sesiones de acondicionamiento para formar la asociación de estímulo en comparación con los controles no lesionados en TEBC63, mientras que el rendimiento en el acondicionamiento de parpadeo retardado, que carece de un intervalo de seguimiento, es solo mínimamente , en todo caso, afectado64,65.

Nuestros hallazgos aquí identificaron disociaciones funcionales entre dos importantes vías prefrontal-talámicas al descubrir el aumento inducido por el aprendizaje en la salida prefrontal al RE, lo que indica que la información enviada al RE señala las características relacionales de los estímulos sensoriales. Los estudios futuros deberán investigar qué tipo de información se envía desde el RE al HPC y cómo afecta el procesamiento neuronal del hipocampo que respalda el aprendizaje asociativo temporal.

Todos los datos generados y analizados en este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Este trabajo fue apoyado por NSERC Discovery Grant (RGPIN-2020-04479) y CFI Leaders Opportunity Fund (25026; [KT-N.]), y el programa NSERC Postgraduate Scholarships-Doctoral (PGSD2-535097; [XY]) .

Departamento de Biología Celular y de Sistemas, Universidad de Toronto, Toronto, Canadá

Xiaotian Yu y Kaori Takehara-Nishiuchi

Programa de Biología Humana, Universidad de Toronto, Toronto, Canadá

Arena Jemberé

Departamento de Psicología, Universidad de Toronto, Toronto, Canadá

Kaori Takehara-Nishiuchi

Programa Colaborativo en Neurociencia, Universidad de Toronto, Toronto, Canadá

Xiaotian Yu y Kaori Takehara-Nishiuchi

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Diseño experimental por XY y KT-N.; todas las cirugías y experimentos realizados por XY con FJ asistiendo con histología; todos los datos analizados por XY con la guía de KT -N.; primer borrador del manuscrito escrito por XY y KT -N.; manuscrito editado por todos los autores; manuscrito finalizado preparado por XY y KT -N.

Correspondencia a Kaori Takehara-Nishiuchi.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Yu, X., Jembere, F. y Takehara-Nishiuchi, K. Las proyecciones prefrontales al núcleo reuniens señalan la relevancia conductual de los estímulos durante el aprendizaje asociativo. Informe científico 12, 11995 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-15886-0

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Recibido: 02 Mayo 2022

Aceptado: 30 de junio de 2022

Publicado: 14 julio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-15886-0

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