La plasticidad mediada por neurogénesis se asocia con una actividad neuronal reducida en CA1 durante la recuperación de la memoria del miedo contextual

May 28, 2023

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 7016 (2022) Citar este artículo

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Se ha demostrado que la neurogénesis hipocampal postnatal afecta el aprendizaje y la memoria de muchas maneras. Varios estudios ahora han demostrado que el aumento de la neurogénesis puede inducir el olvido de los recuerdos adquiridos antes de la manipulación de la neurogénesis y, como resultado de este olvido, también puede facilitar un nuevo aprendizaje. Sin embargo, los mecanismos que median el olvido inducido por la neurogénesis no se comprenden bien. Aquí, utilizamos un análisis basado en subregiones del gen temprano inmediato c-Fos, así como fotometría de fibra in vivo para determinar los cambios en la actividad correspondientes al olvido inducido por neurogénesis. Descubrimos que el aumento de la neurogénesis condujo a una actividad reducida de CA1 durante la recuperación de la memoria contextual. También demostramos aquí que la expresión neta perineuronal en las áreas CA1 está alterada bidireccionalmente por los niveles o la actividad de las neuronas generadas posnatalmente en la circunvolución dentada. Estos resultados sugieren que la neurogénesis puede inducir el olvido al interrumpir las redes perineuronales en CA1 que, de otro modo, podrían proteger los recuerdos de la degradación.

La proliferación e integración posnatal de nuevas neuronas en el cerebro de los mamíferos es una forma única de plasticidad que tiene el potencial tanto de crear nueva conectividad como de interrumpir los circuitos existentes. Como consecuencia, existen numerosas implicaciones para la neurogénesis posnatal como modulador de la estructura y función del hipocampo. Algunas teorías recientes sugieren que la neurogénesis posnatal es fundamental para dar forma a los circuitos del hipocampo para optimizar el aprendizaje futuro1. Otro trabajo previo ha demostrado que, en muchos casos, los niveles elevados de neurogénesis impactan positivamente en procesos como el aprendizaje2,3,4, la memoria5,6 y la flexibilidad cognitiva4,7. Trabajos recientes también han demostrado que además de las influencias positivas que la neurogénesis puede tener sobre el aprendizaje y la memoria, también hay un debilitamiento de los recuerdos que se formaron antes de la elevación de la neurogénesis8,9,10,11,12,13,14, 15. En última instancia, este papel de la neurogénesis posnatal también es beneficioso, ya que mitiga la interferencia proactiva entre los recuerdos antiguos y los nuevos. Esto ocurre particularmente en situaciones donde hay conflicto entre los dos recuerdos, como en el caso del aprendizaje inverso. Como resultado, el olvido inducido por la neurogénesis es beneficioso para el aprendizaje, ya que permite una adquisición más rápida de nuevos recuerdos10. Este efecto "retrógrado" de la neurogénesis afecta a una amplia variedad de tipos de memoria, ocurre tanto en mujeres como en hombres y ocurre independientemente de cómo se incrementen los niveles de neurogénesis (es decir, métodos genéticos, químicos, físicos). Por el contrario, la disminución de la neurogénesis reduce el olvido de los recuerdos previamente adquiridos y ralentiza la adquisición de nuevos recuerdos conflictivos10. Juntos, estos resultados demuestran la importancia de la neurogénesis posnatal para mantener el equilibrio entre estabilidad y plasticidad y cómo esto puede modular preferentemente el aprendizaje frente a la memoria.

El olvido inducido por la neurogénesis es un fenómeno robusto y fiable8,9,10,11,12,13,14,15. Sin embargo, los mecanismos que median la reducción de la fuerza de la memoria no han sido claramente identificados. Las nuevas neuronas se integran en el circuito del hipocampo existente y, como resultado, pueden sobrescribir las sinapsis maduras existentes16,17. Como tal, se ha propuesto que la neurogénesis provoca el olvido a través de la reconfiguración de la fibra musgosa al circuito CA3, ya que las células DG recién nacidas forman conexiones, lo que lleva a una falla en la reactivación del rastro de memoria original8. El modelado computacional de los efectos de la neurogénesis en el circuito del hipocampo ha encontrado que la adición de nuevas unidades más excitables al DG después de que la red ha sido entrenada en un patrón determinado provoca una reducción en la tasa de reactivación de las unidades CA3 que fueron previamente activadas por ese patrón18. De hecho, la ablación de la neurogénesis afecta la reactivación de las células del engrama en el CA3 durante el recuerdo del miedo19, lo que demuestra que las células DG recién nacidas tienen un efecto significativo en la actividad del CA3 durante la recuperación de la memoria.

Hasta la fecha, los modelos computacionales y las predicciones sobre los posibles mecanismos se han centrado en gran medida en el GD y sus importantes interacciones con las estructuras de entrada y salida inmediatas (p. ej., la corteza entorrinal y CA320,21,22). Al principio de su maduración, las células granulares nacidas posnatalmente hacen sinapsis preferentemente con las interneuronas CA3 en lugar de las neuronas excitatorias23, lo que significa que la adición de nuevas neuronas puede no solo tener el efecto de "sobrescribir" las conexiones de fibras musgosas más antiguas, sino también causar un amplio aumento en inhibidor conducir dentro del CA3. Aunque es casi seguro que los efectos en el CA3 desempeñan un papel, se ha demostrado que la neurogénesis tiene efectos aguas abajo más allá de la vía de la fibra musgosa. Por ejemplo, el aumento de la neurogénesis provoca una mayor inhibición en CA3 y CA116,21. Dado que la vía colateral de Schaffer tiene una conectividad más densa que la vía de la fibra musgosa24,25,26,27, los cambios inducidos por la neurogénesis en la actividad de CA3 podrían conducir a cambios aún mayores en la actividad de CA1. Por lo tanto, aquí buscamos examinar el impacto de la neurogénesis posnatal en la actividad de DG, CA3 y CA1.

Presumimos que la neurogénesis posnatal afecta la recuperación de recuerdos previamente adquiridos al alterar la actividad o la excitabilidad de las subregiones del hipocampo corriente abajo. Probamos esta hipótesis examinando los cambios dependientes de la neurogénesis en la actividad de las subregiones del hipocampo durante la recuperación de la memoria. Nuestros resultados apuntan a una actividad alterada de CA1 que puede estar mediada por el deterioro de las redes perineuronales como un mecanismo subyacente al olvido inducido por la neurogénesis. Estos hallazgos proporcionan una descripción mecánica de los efectos retrógrados de la neurogénesis posnatal y también ayudan a reconciliar los efectos anterógrados pro-mnemotécnicos de la neurogénesis posnatal con los efectos pro-olvido observados en la dirección retrógrada.

Nuestro primer objetivo fue confirmar el impacto del ejercicio voluntario en la retención de la memoria en dirección retrógrada (Fig. 1a). Para hacerlo, primero entrenamos ratones para establecer la memoria del miedo contextual (Fig. 1b). Para aumentar la neurogénesis, a la mitad de los ratones se les dio una rueda para correr durante 4 semanas y la otra mitad permaneció sedentaria en condiciones de alojamiento estándar. Después de esta manipulación, observamos una disminución significativa en la recuperación de la memoria en el grupo de corredores (Fig. 1c), de acuerdo con informes anteriores de que la neurogénesis elevada induce el olvido. Para confirmar que correr aumentó la neurogénesis, examinamos el marcador de neuronas inmaduras DCX y observamos un aumento significativo en la cantidad de células marcadas en la circunvolución dentada de los corredores (Fig. 1d, e). Para determinar si la interrupción de la memoria contextual después del ejercicio voluntario es específica de los recuerdos adquiridos antes de la manipulación, realizamos un experimento de estilo anterógrado en el que a los ratones se les dio acceso a una rueda para correr antes del condicionamiento del miedo contextual (Fig. S2a complementaria). Luego probamos los ratones 30 días después. A pesar del período anterior de ejercicio voluntario, no observamos diferencias significativas entre los grupos de control y de carrera en la adquisición de memoria de miedo contextual (Figura complementaria S2b) o la recuperación posterior (Figura complementaria S2c). Juntos, estos resultados demuestran que el ejercicio voluntario induce un gran aumento en la neurogénesis y modula fuertemente la fuerza de los recuerdos dependientes del hipocampo existentes.

Correr induce la neurogénesis, promueve el olvido de la información previamente adquirida y altera la actividad de CA1. (a) Después del entrenamiento en un paradigma de condicionamiento contextual, los ratones se alojaron de manera convencional (n = 14) o se les dio acceso a la rueda para correr (n = 14) durante 30 días antes de probar la retención de la memoria. (b) No hubo diferencia en la proporción de tiempo congelado entre los grupos durante el condicionamiento del miedo contextual. (c) Correr promovió el olvido del contexto condicionado medido por una disminución en la congelación en comparación con los ratones de control sedentarios. ( d ) Ejemplo de etiquetado de doblecortina (cian) en la circunvolución dentada de ratones de los grupos de control y de ejecución. Barras de escala, 50 μm. (e) Los ratones a los que se les dio acceso a ruedas para correr mostraron un aumento en la neurogénesis. ( f ) Ejemplos de neuronas c-fos + (cian) en las subregiones del hipocampo durante la recuperación de la memoria del condicionamiento del miedo contextual. Barra de escala de visión general del hipocampo, 500 μm. Barra de escala de gran aumento, 50 μm. ( g ) Correr no alteró la densidad de neuronas c-fos + en el DG o CA3, pero aumentó la expresión de c-fos en el área CA1. (h) Esta alteración se ilustra adicionalmente en un gráfico del tamaño del efecto (d de Cohen), que muestra que solo hubo una disminución dependiente de la condición que excedía el IC del 95 % con arranque en CA1. El análisis de datos utilizó la prueba T de dos muestras (b, c, e), ANOVA (e) con la prueba post-hoc de Tukey y estadísticas de estimación de dos grupos múltiples con la d de Cohen como medida del tamaño del efecto (h). *P < 0,05. Los datos que se muestran son la media ± sem Consulte la Tabla complementaria S1 para un análisis estadístico completo.

Varios estudios previos8,9,10,11,12,13,14,15 han demostrado que el olvido de recuerdos previamente adquiridos es inducido por la elevación de la tasa de neurogénesis posnatal y nuestros resultados actuales confirman estos hallazgos previos. Nuestro próximo objetivo era determinar si podíamos observar patrones interrumpidos de la actividad del hipocampo que subyacen al olvido inducido por la neurogénesis como un primer paso para determinar el mecanismo por el cual los recuerdos se debilitan. Para ello, examinamos la expresión de c-fos, como proxy de neuronas activadas28,29,30,31,32, en diferentes subregiones del hipocampo. Observamos una interacción significativa de grupo por región en la expresión de c-fos (Fig. 1f-g). No hubo diferencias significativas en la densidad de expresión de c-fos en el gyus dentado o el área CA3. Sin embargo, el grupo de corredores tuvo una disminución significativa de c-Fos en el área CA1 en comparación con el grupo de control.

Si bien la diferencia fue significativa solo en CA1, también observamos una tendencia hacia una disminución en la expresión de c-fos en CA3. Para analizar más a fondo estos cambios, realizamos estadísticas de estimación para examinar los tamaños del efecto en cada subregión. Curiosamente, parece haber un gradiente de efecto que aumenta desde el DG hasta CA3 y CA1 (Fig. 1f-g), lo que sugiere que el impacto de la neurogénesis posnatal es menor en el sitio de su integración física que aguas abajo en el hipocampo. circuitos

También examinamos la expresión de c-Fos de ratones en condición anterógrada donde la neurogénesis fue modulada por el ejercicio voluntario antes de la adquisición de la memoria. Como se discutió anteriormente, no hubo deterioro de la memoria en la condición anterógrada como resultado de correr. Además, en esta condición, no hubo efecto de correr en la expresión de c-Fos en ninguna de las subregiones del hipocampo durante la recuperación de memoria posterior (Figura complementaria S2d, e). Esto apoya firmemente la idea de que la reducción de CA1 c-Fos en la condición retrógrada es una consecuencia de la disminución de la retención de memoria.

Habiendo identificado una firma dependiente de la actividad de la recuperación de la memoria deteriorada en el área CA1, luego realizamos fotometría de fibra en esta región para desarrollar una comprensión más matizada de los cambios de actividad relacionados con el olvido inducido por la neurogénesis. Se usó el mismo paradigma de comportamiento y línea de tiempo que el anterior, excepto que expresamos viralmente GCaMP7f33 para monitorear la actividad de la población del área CA1 durante el aprendizaje contextual del miedo y la recuperación de la memoria posterior a la ejecución (Fig. 2a, b). Como se muestra en nuestros experimentos con c-Fos (Fig. 1), demostramos primero que la carrera voluntaria aumentó la neurogénesis (Fig. 2c, d) y, en la medida en que la neurogénesis aumentó con la carrera voluntaria, observamos una disminución significativa en la congelación ( Figura 2e). También encontramos una correlación significativa entre la neurogénesis y la retención de la memoria en los corredores (Fig. 2f). Antes de la manipulación voluntaria del ejercicio, no observamos ninguna diferencia de grupo en la adquisición de miedo contextual o en ninguna métrica relacionada con la fotometría de fibra durante el entrenamiento (Figura complementaria S3). Después de un mes de ejecución, realizamos grabaciones de fotometría en una jaula de ratón limpia para determinar si la ejecución tenía un efecto no específico (es decir, no mnemotécnico) en la actividad de la población de CA1 (grabaciones representativas presentadas en la Fig. S4 complementaria). No hubo diferencias significativas entre los grupos de corredores y sedentarios con respecto a la actividad de calcio inicial (Fig. 2g), lo que indica que el ejercicio voluntario no causa un cambio general en la actividad de CA1. Luego transferimos inmediatamente a los ratones a las cámaras de miedo contextual. Al hacerlo, observamos un aumento en GCaMP7f. actividad en el grupo de control que se atenuó significativamente en los corredores (Fig. 2h). Calculamos el área bajo la curva para cada rastro de fotometría y observamos que esta métrica se correlacionó significativamente con la fuerza de la memoria medida por el tiempo dedicado a la congelación tanto en el grupo de control como en el de ejecución (Fig. 2i, j). Estos resultados fotométricos iniciales son indicativos de una actividad poblacional reducida en CA1 luego de un ejercicio voluntario que es específico para la recuperación de la memoria. Esto es consistente con los cambios de expresión de c-Fos que se muestran en la Fig. 1.

La neurogénesis inducida por la carrera aumenta la actividad específica del comportamiento de CA1. (a) Los ratones se infectaron con GCaMP7f. antes del condicionamiento del miedo contextual. Luego, los ratones se alojaron de manera convencional (n = 14) o con una rueda para correr (n = 10) durante 30 días antes de una prueba de memoria. La fotometría de fibra se realizó durante el entrenamiento y la recuperación de la memoria. ( b ) Microfotografía representativa de GCaMP7f. expresión (cian). Barra de escala general, 100 μm. Barra de escala CA1, 100 μm. (c) Los corredores mostraron un aumento en la neurogénesis. ( d ) Ejemplo de etiquetado de doblecortina (cian) en control y corredores. Barra de escala de vista general dentada, 100 μm. Barra de escala de gran aumento, 50 μm. (e) Correr promovió el olvido de la memoria contextual. (f) En los corredores, el aumento en el etiquetado de doblecortina se correlacionó con la fuerza de la memoria. (g) Durante los registros de fotometría en una jaula doméstica limpia antes de la prueba de retención, no hubo diferencia en la media de GCaMP7f. actividad entre corredores y controles. (h) Una vez transferidos a la cámara de acondicionamiento, los ratones de control mostraron un aumento significativamente mayor en la media de GCaMP7f. actividad de un contexto a otro en comparación con los corredores. (i) GCaMP7f medio. fluorescencia a través de la prueba de memoria de contexto con la congelación del grupo mediano trazada arriba. Consulte la figura: Fig. 1 complementaria para ver las trazas medias de grupo no corregidas desde el punto de referencia y los registros individuales representativos. (j) En ambos grupos el área bajo el GCaMP7f. la curva de fluorescencia a lo largo del ensayo se correlacionó significativamente con el porcentaje de congelación. Luego, las grabaciones de fotometría se separaron por expresión conductual. ( k ) El área bajo la curva se suprimió en los corredores independientemente de la expresión del comportamiento. (l) La altura media del pico de la señal de fotometría no difirió entre condiciones o por expresión de comportamiento. ( m ) Los ratones de control mostraron un aumento en GCaMP7f. frecuencia máxima (picos/s) durante el movimiento en relación con la congelación. Los corredores no lograron mostrar este aumento de frecuencia específico del comportamiento durante el movimiento. El análisis de datos utilizó la prueba T de dos muestras (c, e, g, h) y ANOVA de dos vías (k, l, m) con la prueba post-hoc de Tukey. *P < 0,05. Los datos que se muestran son la media ± sem Consulte la Tabla complementaria S2 para un análisis estadístico completo.

A continuación, nos interesó determinar si podíamos diferenciar el grupo de control frente al de ejecución en función de la actividad diferencial de CA1 durante los comportamientos de congelación versus los de no congelación. Examinamos el AUC y observamos una disminución significativa en los corredores (Fig. 2k). Sin embargo, esto disminuyó constantemente durante el movimiento y la congelación. También analizamos la frecuencia máxima y, aunque no hubo un efecto principal significativo del grupo, hubo un grupo significativo por interacción de comportamiento. Examinamos la altura media del pico y descubrimos que esta métrica no fue significativamente diferente entre los grupos y tampoco cambió en función del comportamiento de congelación versus no congelación (Fig. 2l). Durante episodios de congelación, tanto los controles como los corredores mostraron una frecuencia máxima baja. Durante los episodios de movimiento, los ratones de control exhibieron un aumento significativo en la frecuencia máxima de CA1 que no se observó en el grupo de carrera (Fig. 2m). Esto sugiere que las diferencias dependientes del comportamiento en la frecuencia máxima probablemente no se deban al reclutamiento de neuronas adicionales (en cuyo caso se esperaría un aumento en la altura máxima) sino a cambios en la frecuencia de la misma población de neuronas34.

Las redes perineuronales (PNN) han propuesto roles en la modulación de la plasticidad, la excitabilidad y la fuerza de la memoria35,36,37. Previamente se ha demostrado que factores como el acceso a la rueda para correr y la edad alteran la densidad de expresión de las PNN en el hipocampo38,39. Si bien ambos factores también afectan la neurogénesis, solo se ha planteado la hipótesis de un vínculo entre los dos40. Especulamos que la relación entre la neurogénesis posnatal y el patrón de expresión de los PNN podría explicar potencialmente la disminución asociada en la expresión de la memoria. Por lo tanto, cuantificamos la densidad de PNN en DG, CA3 y CA1 de ratones que se habían sometido a manipulación posterior al aprendizaje de la neurogénesis con ejercicio voluntario (Fig. 3a). Curiosamente, observamos el mismo patrón de cambios que se observó con la expresión de c-Fos, es decir, una interacción por región con una reducción de la densidad de PNN en el CA1 del grupo de ejecución (Fig. 3b, c). Usando microscopía confocal de gran aumento, examinamos el área de superficie de los PNN restantes en el CA1 y encontramos que, además de la disminución en el número total, también hubo una disminución en la contigüidad de la estructura de la superficie en el grupo de ejecución, potencialmente indicativo de degradación de los PNN (Fig. 3d-f). Curiosamente, para examinar la medida en que la neurogénesis per se interrumpe la expresión neta perineuronal, correlacionamos tanto la contigüidad como la densidad de los PNN con el número de neuronas inmaduras marcadas con DCX. En ambos casos, hubo fuertes correlaciones inversas en el grupo de control (significativas en el caso de la contigüidad y una tendencia casi significativa con la densidad de PNN), mientras que estas correlaciones fueron débiles y no significativas en el grupo de carrera (Fig. 3g, h).

La neurogénesis inducida por la carrera disminuye la densidad y la contigüidad de las redes perineuronales en CA1. ( a ) Fotomicrografía representativa de la expresión de PNN (cian) en el hipocampo, con imágenes de gran aumento de CA1, CA3 y la circunvolución dentada. Barra de escala de visión general del hipocampo, 500 μm. Barra de escala de gran aumento, 50 μm. ( b ) Densidad de expresión de PNN en controles (n = 8) y corredores (n = 7). Barras de escala, 250 μm. ( c ) La neurogénesis inducida por la carrera disminuyó la densidad de expresión de los PNN en CA1. ( d ) Se recopilaron imágenes de alta resolución de PNN del CA1 y ( e ) se binarizaron utilizando umbrales para evaluar la contigüidad. Barras de escala, 25 μm. ( f ) La neurogénesis inducida por la carrera disminuyó la contigüidad de los PNN en CA1. En la condición de control, la densidad de células de doblecortina + mostró una alta tendencia en la dirección anti-correlacionada con (g) densidad de expresión de CA1 PNN y (h) contigüidad de CA1 PNN, mientras que ninguna de estas correlaciones fue significativa en la condición de ejecución. El análisis de datos utilizó ANOVA (c) con la prueba de Tukey durante las comparaciones múltiples post-hoc y la prueba T de dos muestras (f). *P < 0,05. Los datos que se muestran son la media ± sem Consulte la Tabla complementaria S3 para un análisis estadístico completo.

Para determinar aún más si la neurogénesis es de hecho el factor que modula la expresión de las redes perineuronales en CA1, investigamos reguladores adicionales de la neurogénesis posnatal. Como mecanismo adicional para aumentar la neurogénesis, tratamos ratones con memantina11 y para disminuir la neurogénesis usamos temozolomida41 (TMZ). En comparación con los ratones inyectados con solución salina, el tratamiento con memantina resultó en una disminución significativa en la expresión de PNN en CA1 (pero no en DG o CA3), tal como se observó con la carrera voluntaria. TMZ, por otro lado, redujo la neurogénesis y posteriormente aumentó la expresión de PNN en CA1 (Fig. 4a, b).

La actividad de las células granulares inmaduras en la circunvolución dentada está inversamente relacionada con la densidad de las redes perineuronales en CA1. (a) 4 semanas de tratamiento con TMZ (n = 5) aumentaron la densidad de expresión y el tratamiento con memantina (n = 5) disminuyó la densidad de expresión de PNN en CA1 en relación con los controles tratados con solución salina (n = 5). Este efecto de tratamiento no estuvo presente en la circunvolución dentada o CA3. (b) El tratamiento con memantina indujo un aumento en la neurogénesis, mientras que el tratamiento con TMZ redujo la neurogénesis en relación con los controles tratados con solución salina. ( c ) La densidad de expresión de PNN en CA1 aumentó con la edad durante la adolescencia, tiempo durante el cual ( d ) disminuyó la neurogénesis. ( e ) Se implantaron fibras ópticas en la circunvolución dentada de ratones tg + (n = 4) y tg- (n = 4) Nestin-ChR2 14 días antes del condicionamiento contextual. A continuación, se estimularon las neuronas inmaduras que expresan nestina en la circunvolución dentada durante 5 min al día a 10 Hz durante 14 días. Los ratones se reintrodujeron en el contexto acondicionado 28 días después del acondicionamiento. ( f ) Durante la reintroducción al contexto condicionado, los ratones ChR2 tg + mostraron problemas de memoria en relación con los controles ChR2 tg-. ( g ) Los ratones ChR2 tg + también mostraron una disminución significativa en la densidad de expresión de CA1 PNN. ( h ) Estos cambios en la recuperación de la memoria y la densidad de expresión de CA1 PNN ocurrieron en ausencia de diferencias en la densidad de expresión de doblecortina + neuronas inmaduras. El análisis de datos utilizó ANOVA (a–d) con la prueba de Tukey durante las comparaciones múltiples post-hoc y la prueba T de dos muestras (f–h). *P < 0,05. Los datos que se muestran son la media ± sem Consulte la Tabla complementaria S4 para un análisis estadístico completo.

La neurogénesis posnatal en el hipocampo depende en gran medida de la edad del animal. Los ratones jóvenes tienen niveles significativamente mayores de neurogénesis que los ratones viejos, y la disminución de la neurogénesis comienza temprano en la vida14,42. Por lo tanto, buscamos utilizar la edad como un modulador natural adicional de la neurogénesis posnatal para examinar las diferencias en la expresión de PNN. Si la integración de las neuronas generadas posnatalmente regula negativamente la expresión de CA1 PNN, esperaríamos un aumento en la expresión de PNN con el aumento de la edad. Para probar esto, cuantificamos la expresión de PNN en CA1 de ratones que tenían 1, 2 o 4 meses de edad. Como era de esperar, observamos una disminución significativa dependiente de la edad en la neurogénesis y un aumento correspondiente dependiente de la edad en los PNN en CA1 (Fig. 4c, d) 43. Estos resultados proporcionan evidencia de apoyo adicional de que los niveles de neurogénesis posnatal en el giro dentado afectan la expresión de CA1 PNN.

Juntos, los resultados de estas diversas manipulaciones sugieren fuertemente que la neurogénesis posnatal moduló la expresión de PNN en el área CA1. Pero, ¿cómo afecta la neurogénesis posnatal en la DG a la expresión de PNN en CA1? La actividad neuronal directa y/o local se ha relacionado previamente con la modificación de los PNN44,45,46. Presumimos que la actividad de las neuronas generadas posnatalmente podría alterar la actividad del circuito de la DG, lo que resultaría en cambios de PNN en CA1. Para examinar el impacto de la actividad de las nuevas neuronas, utilizamos una línea de ratón Nestin-Cre/ERT2 para expresar ChR2 en neuronas inmaduras. La estimulación optogenética de esta población de neuronas inmaduras se aplicó diariamente durante 2 semanas comenzando 24 h después del condicionamiento del miedo contextual. Este enfoque optogenético fue suficiente para inducir el olvido de la memoria de miedo contextual adquirida previamente cuando se probó un mes después del aprendizaje inicial (Fig. 4e, f). La estimulación optogenética disminuyó significativamente la expresión de PNN en CA1 en comparación con el grupo de control no estimulado (Fig. 4g). Sin embargo, no aumentó el número de células DCX+ en el DG (Fig. 4h). Juntos, estos hallazgos demuestran que la actividad de las neuronas inmaduras en el DG puede tener un impacto directo en la expresión de CA1 PNN.

Nosotros y otros hemos demostrado que la neurogénesis postnatal elevada está inversamente relacionada con la fuerza de los recuerdos adquiridos antes de que aumente la neurogénesis8,9,10,11,12,13,14,15. Aquí, buscamos examinar los mecanismos subyacentes a esta forma de olvido inducido por neurogénesis (Fig. 5). Comenzamos identificando cambios en la expresión de c-Fos dependiente de la experiencia en el HPC asociados con el olvido. Descubrimos que la recuperación de memoria de miedo contextual reducida estuvo acompañada por una expresión reducida de c-Fos específicamente dentro del subcampo CA1. Este resultado apunta a la importancia de CA1 en la recuperación de la memoria y sugiere que la neurogénesis posnatal interrumpe el almacenamiento y/o la recuperación de la memoria en esta región. Se ha demostrado que el CA1 está activo durante el recuerdo de los recuerdos de miedo del contexto47,48 y se pueden inducir alteraciones en el recuerdo de la memoria del miedo a través de la interrupción optogenética del CA149,50. Algunos también han propuesto que el CA1 actúe no como una región de almacenamiento per se, sino como un circuito de decodificación para memorias almacenadas de manera ortogonal en CA351. Independientemente de la función exacta del CA1, la interrupción de su actividad claramente tiene implicaciones críticas para la recuperación de la memoria.

Resumen de resultados. Combinados, estos resultados muestran que el aumento de la neurogénesis provoca grandes efectos posteriores en la actividad y la densidad de expresión de PNN del área CA1. Curiosamente, los efectos están ausentes en DG y CA3, donde no se informaron diferencias en las densidades de expresión de PNN de c-Fos, a pesar de que estas áreas son más próximas a las células granulares nacidas posnatalmente. Sobre esta base, sugerimos que los mecanismos importantes del olvido inducido por la neurogénesis se encuentran en los cambios fisiológicos que aparecen distalmente y aguas abajo en el CA1.

Para investigar más a fondo los cambios de actividad en CA1 asociados con el olvido inducido por neurogénesis, realizamos fotometría de fibra in vivo. Si el aumento de la neurogénesis (o, alternativamente, los efectos no específicos del ejercicio voluntario) resultara en una disminución generalizada de la actividad que bloqueara la recuperación, entonces predeciríamos una disminución de la señal de referencia de Ca2+ en Ca1. Sin embargo, no observamos una diferencia de referencia en la actividad, sino que demostramos que el olvido se asoció con una reducción general específica del contexto en la señal de CA2+ de la población de CA1, así como con una disminución dependiente del comportamiento en la frecuencia máxima durante el movimiento. La disminución de estos dos representantes de la actividad neuronal en el CA1 durante la recuperación de la memoria deteriorada sugiere que el CA1 juega un papel crítico en el almacenamiento de los recuerdos de contexto y que el aumento de la neurogénesis induce el olvido al modular el almacenamiento de la memoria en CA1.

Hay controles importantes que deben tenerse en cuenta al evaluar los datos de fotometría de fibra, para evitar la influencia de artefactos de movimiento en la señal. Además del canal GCaMP de 470 nm, también registramos la intensidad de fluorescencia de un canal de 415 nm como es estándar para la fotometría de fibra52,53,54,55,56. El canal de 415 nm es consistente con el punto isosbéstico de GCaMP7f33; por lo tanto, la intensidad de fluorescencia resultante registrada en respuesta a esta longitud de onda se considera independiente de la unión de calcio. Luego se supone que las desviaciones en la señal de fluorescencia observadas en el canal isosbéstico son eventos relacionados con el movimiento y el ruido y se controlan post hoc en la señal GCaMP dependiente de calcio restando la señal relacionada con el ruido después de haber escalado linealmente las señales para tener en cuenta el canal. -relacionadas con diferencias en la amplitud de respuesta57,58.

En el estudio actual, sincronizamos la señal de fotometría con grabaciones de comportamiento. Esto nos permitió comparar las señales de fotometría durante episodios discretos de movimiento y mientras los ratones se congelaban, un indicador de la retención de la memoria. Durante el recuerdo de la memoria contextual, las áreas bajo la curva de los rastros de fotometría estaban altamente correlacionadas con el movimiento (Fig. 2j), pero es poco probable que se deban a un artefacto de movimiento. Si esta correlación fuera el resultado de un artefacto de movimiento, también se habría esperado durante la sesión de acondicionamiento. Sin embargo, encontramos que las magnitudes de las áreas bajo la curva de las huellas de fotometría no se correlacionan con el movimiento durante la adquisición de la memoria contextual (Fig. S3c complementaria). Esto sugiere que la relación entre la señal de fotometría y el movimiento no está relacionada con un artefacto de movimiento, sino que se relaciona con la respuesta de congelación específica de la especie como un representante de la memoria del miedo contextual. Una advertencia potencial para los análisis de fotometría realizados en el proyecto actual es la falta de seguimiento del aparato locomotor durante el período de registro de referencia; sin embargo, no se observaron diferencias en el comportamiento locomotor durante el condicionamiento del contexto (Fig. S3a complementaria).

Después de evaluar los efectos de la neurogénesis en la actividad de CA1, investigamos los cambios inducidos por la neurogénesis en las redes perineuronales en las subregiones del hipocampo en función de las funciones propuestas de estos componentes de la matriz extracelular en la modulación, la plasticidad y la excitabilidad59. Proporcionamos evidencia congruente del impacto de los moduladores positivos (running9,10,12, memantine11) y los moduladores negativos (TMZ9, aging60) de la neurogénesis posnatal en la expresión de PNN en el área CA1 del hipocampo. Mientras que la disminución de la neurogénesis se asoció con una mayor expresión de PNN dentro del área CA1, el aumento de la neurogénesis se asoció con una disminución de la expresión de PNN en CA1.

La evidencia previa indica que las redes perineuronales en el área CA1 protegen la estabilidad de los recuerdos a largo plazo y que su eliminación disminuye el almacenamiento de memoria a través de un mecanismo que implica una mayor actividad de las interneuronas que expresan parvalbúmina35. También se ha sugerido que la eliminación de las redes perineuronales de CA1 actúa para restringir la depresión a largo plazo (LTD)37,61. Dado que LTD puede conducir a la eliminación de sinapsis62, esto también podría conducir a una disminución en la expresión de la memoria. Cualquiera de estos mecanismos, o ambos, podrían ser inducidos por la reducción en la expresión neta perineuronal de CA1 que identificamos al aumentar el número o la actividad de las neuronas generadas posnatalmente. Estos mecanismos también son consistentes con patrones disminuidos de actividad de CA1 que hemos observado aquí. Si la reducción neta perineuronal aumenta la frecuencia de las interneuronas PV como se ha demostrado anteriormente, entonces se esperaría una disminución resultante en la excitación de CA1 como se observó en términos de expresión de c-Fos y actividad de GCAMP7.

Nuestros hallazgos de cambios en la densidad de expresión de CA1 PNN con el envejecimiento y el ejercicio voluntario son consistentes con informes anteriores38,39. Sin embargo, estos informes anteriores no evaluaron la neurogénesis, un proceso que se altera en ambas condiciones. En el presente estudio, demostramos una densidad de expresión de PNN alterada en el CA1 en cinco condiciones en las que se alteran las neuronas nacidas después del nacimiento. Además, mostramos aquí que la estimulación optogenética directa de neuronas inmaduras generadas posnatalmente en la circunvolución dentada, sin alterar el número de nuevas neuronas, indujo tanto el olvido de una memoria previamente adquirida como la remodelación de las redes perineuronales en el área CA1. Este patrón replica el fenómeno conductual que hemos observado con la carrera como modulador de la neurogénesis posnatal. Previamente se ha demostrado utilizando la inhibición transgénica y de carrera combinada de la neurogénesis posnatal, que los efectos de la carrera sobre el olvido de los recuerdos previamente adquiridos dependen específicamente del aumento de la neurogénesis. Nuestra observación, que la estimulación optogenética directa de nuevas neuronas induce el olvido, proporciona más evidencia del efecto específico del aumento de la excitabilidad de las neuronas generadas posnatalmente asociadas con la neurogénesis en este fenómeno.

Trabajos recientes han demostrado que la densidad de redes perineuronales en el hipocampo puede modificarse bidireccionalmente mediante estimulación o inhibición artificial directa utilizando DREADDs46. Sin embargo, hasta donde sabemos, nuestros resultados actuales se encuentran entre los primeros en demostrar la interrupción inducida por la actividad de las redes perineuronales que ocurren a través de una vía polisináptica en lugar de una estimulación que se localiza en la región de interés o se dirige a los PNN mismos. Esto enfatiza aún más que aunque la neurogénesis posnatal puede modular la conectividad estructural del circuito local en la circunvolución dentada y proximalmente con CA3, las consecuencias funcionales de la actividad de nuevas neuronas pueden observarse en áreas que no están conectadas directamente con la circunvolución dentada. Investigaciones anteriores han encontrado que las nuevas neuronas en el DG se incorporan preferentemente con interneuronas hiliares e interneuronas CA323. Por lo tanto, el aumento de la neurogénesis podría haber resultado en un cambio hacia un impulso más inhibidor del DG al CA3, lo que resultó en una disminución de la expresión de c-Fos aguas abajo del DG. Además, se ha demostrado que el aumento de la neurogénesis provoca una mayor inhibición en CA3 y CA1, con un aumento de la actividad de las interneuronas de parvalbúmina en ambas regiones y una disminución de las ondas agudas de CA163.

Una explicación de por qué nuestros efectos c-fos y PNN parecen mayores en el CA1 puede ser que las conexiones DG-CA3 son bastante escasas en comparación con las conexiones CA3-CA124,25,27, lo que significa en teoría que un pequeño cambio en la actividad de la población en el CA3 podría haber amplificado los efectos aguas abajo en el CA1.

El presente estudio proporciona evidencia de olvido inducido por neurogénesis en ratones hembra y sugiere que este mecanismo puede estar mediado en parte por la interrupción de las redes perineuronales en CA1 que, de lo contrario, podrían proteger los recuerdos de la degradación. Este efecto conductual del olvido inducido por la neurogénesis se ha demostrado previamente en roedores hembras y machos9,10,11,13 aunque es posible que los mecanismos subyacentes difieran. Existen diferencias sexuales tanto en el comportamiento durante el condicionamiento contextual64,65,66 como en las tasas de neurogénesis67,68,69, por lo tanto, estudios futuros podrían ampliar estos resultados y evaluar si estos cambios en la densidad de expresión de CA1 PNN también están presentes en ratones macho.

Los resultados del presente estudio son consistentes con las teorías de neurogénesis que reducen el impacto de la interferencia proactiva8,9,70. Debido a las tasas mucho mayores de neurogénesis en los cerebros jóvenes, se ha propuesto que la neurogénesis posnatal puede ser de importancia primordial para los jóvenes como un mecanismo de esculpido de circuitos más que como un componente de la función hipocampal en curso71,72. Sin embargo, la neurogénesis posnatal continúa en animales adultos y de edad avanzada, aunque a un ritmo más bajo73,74,75,76,77,78. El modelado computacional ha demostrado que incluso las tasas de neurogénesis que producen tan solo el 0,2% de la población total de células granulares DG son suficientes para inducir efectos conductuales consistentes con una interferencia proactiva reducida79. Como tal, no creemos que estas dos teorías sean incompatibles o mutuamente excluyentes.

En el presente estudio, solo podemos informar los efectos observados en el contexto del cerebro del ratón y, como tal, se desconoce si la neurogénesis en humanos podría desempeñar un papel similar en el olvido y la regulación de la interferencia proactiva. Numerosos estudios han documentado la neurogénesis en el cerebro humano adulto78,80,81,82,83,84,85,86,87. Varios estudios recientes han reavivado la controversia sobre la existencia de al menos la magnitud de la neurogénesis posnatal en el cerebro adulto88,89,90. En los numerosos estudios que han observado la neurogénesis en el cerebro adulto, la tasa de producción de nuevas neuronas es relativamente baja78. Sin embargo, como se discutió anteriormente, el modelado computacional ha sugerido que incluso niveles muy bajos de neurogénesis posnatal pueden inducir el olvido y, como tal, los bajos niveles de neurogénesis en humanos adultos no impiden esta función en el cerebro humano. Sobre la base del estado de conocimiento existente, aún no es posible determinar la traducibilidad del olvido inducido por la neurogénesis.

La optimización tanto del aprendizaje como de la memoria requiere un equilibrio entre la plasticidad y la estabilidad del circuito. Trabajos anteriores han demostrado que el olvido inducido por la neurogénesis va acompañado de la facilitación de nuevos aprendizajes10. Este efecto multifacético podría explicarse simplemente por un aumento en la plasticidad que cambiaría el equilibrio del circuito para promover la adquisición e interrumpir los recuerdos que requieren la estabilidad de ese circuito para su recuperación. Mecánicamente, proporcionamos pruebas sólidas de que la neurogénesis posnatal altera el equilibrio de este circuito a través de una modulación dependiente de la actividad de las redes perineuronales en el área CA1. En los estudios actuales, investigamos los mecanismos que se relacionan con el olvido inducido por la neurogénesis, pero esta no es la única función en la que se ha implicado a la neurogénesis. Se ha demostrado o teorizado que la neurogénesis posnatal desempeña numerosas funciones, incluida la regulación del estado de ánimo91,92,93,94,95 , flexibilidad cognitiva96,97,98, separación de patrones4,12,99,100, memoria a largo plazo101,102,103. Como tal, no esperamos que haya una función singular de la neurogénesis posnatal. La interacción entre las neuronas generadas posnatalmente y el circuito neuronal existente es compleja y puede haber un mecanismo aguas abajo separado que influya en estos otros factores (p. ej., la cognición o el estado de ánimo). Sin embargo, también puede haber un mecanismo común con respecto a la modulación de los PNN que podría mediar, en parte, en varias de las funciones propuestas de la neurogénesis posnatal. Por ejemplo, la expresión de PNN en múltiples regiones del cerebro, incluida CA1, está implicada en el estrés y los trastornos del estado de ánimo104,105,106. Del mismo modo, los PNN son importantes para el aprendizaje61,107, la memoria35,59,108, la flexibilidad cognitiva109,110 y la formación de circuitos de desarrollo111,112. Para determinar hasta qué punto la expresión alterada de PNN media otras funciones de la neurogénesis posnatal, será necesario un trabajo futuro adicional.

Utilizamos dos cepas de ratones. Se usaron ratones de fondo C57Bl/6N (JAX) para la mayoría de los experimentos. También se usó una línea de ratón transgénico que expresaba CreERT2 bajo la secuencia promotora de nestina (JAX) para el direccionamiento optogenético de neuronas inmaduras. Se usaron ratones hembra en todos los experimentos y tenían 7 semanas de edad al comienzo de la prueba. Los ratones se alojaron en jaulas estándar con tres a cinco ratones por jaula y libre acceso a comida y agua. La iluminación de la habitación se mantuvo en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 ​​h (8 am, luces encendidas). Todas las pruebas de comportamiento y los experimentos de fotometría se realizaron durante la fase del ciclo de luz. Los experimentos se realizaron de acuerdo con las políticas y directrices del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales y fueron aprobados por el comité de cuidado de animales de la Universidad de Calgary. El estudio se informa de acuerdo con las directrices ARRIVE.

Para aumentar la neurogénesis, a los ratones se les dio acceso voluntario a una rueda para correr (Fast Trac™, Med Associates Inc., Fairfax, VT, Estados Unidos, 16 cm de diámetro) en su jaula durante un mes. La carrera voluntaria es un enfoque altamente reproducible y ampliamente utilizado para aumentar la neurogénesis. Se eligió aquí porque se ha utilizado en experimentos anteriores que examinaron el olvido inducido por la neurogénesis, donde se descubrió que los efectos conductuales dependían específicamente del aumento de la neurogénesis9,10,12. Los ratones fueron entrenados para usar ruedas para correr colocándolos suavemente sobre la rueda para correr y obstruyendo su camino fuera de la rueda. Se consideró que los ratones estaban entrenados si corrían sobre la rueda durante aproximadamente 30 s. Las revoluciones de las ruedas se registraron continuamente utilizando el programa de software Wheel Manager (Med Associates Inc., Fairfax, VT, Estados Unidos) y el número de rotaciones de las ruedas se dividió por el número de ratones en la jaula para dar una distancia de carrera estimada por ratón. Los ratones corrieron en promedio 8,1 km (± sem 1,1 km) por día. Los ratones del grupo sedentario se alojaron de forma convencional sin rueda de rodadura, pero tenían elementos de enriquecimiento estándar (casa domo y material de anidación).

Para cuantificar los efectos de la neurogénesis en las redes perineuronales, también se trataron grupos de ratones con temozolomida (TMZ) para disminuir la neurogénesis o memantina para aumentar la neurogénesis. A los ratones de control se les inyectó solución salina al 0,9%. TMZ se administró como se describió previamente41. Inyectamos ratones en 3 días consecutivos por semana durante 4 semanas con una dosis de 25 mg/kg (ip). Se inyectó memantina una vez por semana durante 4 semanas a una dosis de 25 mg/kg (ip). Finalmente, también utilizamos la edad como un modulador naturalista de la neurogénesis posnatal. Se perfundieron ratones hembra C57bl/6 N a las 4, 8 o 12 semanas de edad y las redes perineuronales se etiquetaron como se describe a continuación.

Antes del condicionamiento del miedo contextual, todos los ratones fueron manipulados durante 5 min cada día durante 3 a 5 días hasta que los ratones se calmaron con el manipulador. Las cámaras de acondicionamiento de miedo contextual de Ugo Basile (Gemonio, Italia) (17 cm × 17 cm × 24,7 cm) se colocaron en gabinetes reductores de ruido. El ambiente de acondicionamiento tenía pisos de rejilla de choque (barras separadas 0,5 cm, 0,2 cm de diámetro). El comportamiento se monitoreó usando cámaras infrarrojas aéreas y se calificó automáticamente usando un software de seguimiento automatizado (ANY-Maze, Stoelting, Wood Dale, IL, Estados Unidos). Durante la prueba de entrenamiento de 5 minutos, se permitió a los ratones explorar la cámara durante dos minutos antes de recibir tres descargas (1 mA, 2 s), cada una separada por un intervalo de 1 minuto. Los ratones se sacaron de la cámara de acondicionamiento un minuto después de la última descarga y se colocaron de nuevo en su jaula sin ser molestados durante 24 h. Luego, se introdujeron ruedas para correr en la mitad de los ratones. Después de cuatro semanas de manipular la neurogénesis, los ratones fueron probados en la tarea de miedo contextual durante cinco minutos sin descargas. La rueda de carrera se bloqueó el día anterior a la prueba de comportamiento para evitar un efecto directo del ejercicio en los niveles de actividad durante la prueba. La congelación se usó como la medida principal de retención de la memoria y se definió como una falta total de movimiento, a excepción de la respiración, durante al menos un segundo. La congelación se calculó automáticamente mediante el sistema de software ANY-maze y un experimentador ciego a las condiciones de tratamiento verificó la precisión al azar. Todos los ratones se perfundieron 90 minutos después de la prueba de memoria de contexto para cuantificar la expresión de c-Fos en todo el hipocampo.

En un experimento separado, a los ratones primero se les dio acceso a una rueda para correr durante un mes o se les alojó sin rueda en condiciones estándar. A continuación, se retiraron las ruedas de rodadura y se entrenó a los ratones en un paradigma de condicionamiento del miedo contextual como se describe anteriormente. Luego, un mes después, los ratones fueron evaluados para la memoria contextual. Todos los ratones se perfundieron 90 minutos después de la prueba de memoria de contexto para cuantificar la expresión de c-Fos en todo el hipocampo.

Las cirugías se realizaron bajo anestesia con isoflurano administrado a través de un sistema de administración de anestesia Somnosuite (Kent Scientific) que extrajo oxígeno comprimido puro. Los ratones se indujeron a una concentración de isoflurano al 5 % antes de transferirlos a un marco de cabeza estereotáxico (Kopf) y se mantuvieron a ~ 2 % de isoflurano. La temperatura corporal interna se controló con un termómetro rectal y se reguló con una almohadilla homeotérmica. Se administró analgesia (Anafen; 5 mg/kg; sc) y soporte hídrico (solución de Lactato de Ringer; sc) al inicio de la cirugía. Se afeitó el cuero cabelludo y se limpió con lavados alternos de clorhexidina y etanol al 70% y luego se hizo una incisión a lo largo de la línea media y se lavó el cráneo con H2O2 al 3%. Usando un manipulador estereotáxico robótico emparejado con el software Stereodrive (Neurostar), se midieron las ubicaciones de bregma y lambda, así como dos puntos de 2 mm a cada lado de la línea media para permitir que el software estereotáxico corrija cualquier imperfección leve en la planitud del cráneo. Después de obtener las coordenadas del sitio de inyección e implante, se perforó un agujero de trepanación en el cráneo (AP -2.18; ML ± 2.1; DV a la superficie del cerebro). Una aguja de infusión de vidrio conectada a un sistema de infusión Nanoject III (Drummond Scientific) y rellenada con aceite mineral se introdujo lentamente en el CA1 (AP − 2,18; ML ± 2,0; DV 1,4) antes de inyectar 250 nL de virus (pGP-AAV1-syn -jGCaMP7f.-SV40-WPRE; Addgene) en pulsos de 50 nL cada uno intercalados por ~ 10 s y el pulso final seguido de un período de 10 min en el que se dejó la aguja en su lugar para permitir la difusión. Al final de los 10 min, la aguja se elevó gradualmente fuera del cerebro antes de que se bajara un implante de fibra óptica (NA 0,37, núcleo de 200 µm 2 mm de longitud; neurofotometría) en el CA1 justo lateral al lugar de la inyección (AP - 2,18 ; ML ± 2.1; DV 1.4). Los implantes se fijaron al cráneo aplicando una fina capa de Metabond en la superficie expuesta del cráneo y alrededor de la base del implante. Luego, esta capa se cubrió con acrílico dental negro opaco para formar una cubierta de cabeza a la que se le dio tiempo para que se endureciera antes de cerrar la incisión con material de sutura. Luego, los ratones se retiraron del marco estereotáxico y se les permitió recuperarse durante 2 semanas mientras recibían dosis adicionales de Anafen durante 3 días después de la cirugía.

Antes del entrenamiento conductual y las grabaciones de fotometría de fibra in vivo, se habituó a los ratones a estar conectados al cable de conexión de fibra óptica durante 3 días consecutivos. La fotometría de fibra se realizó utilizando un sistema de neurofotometría FP3002 controlado por el software Bonsai113. El sistema de neurofotometría también recibió pulsos TTL generados por el software Anymaze (Stoelting), que controlaba las cámaras de condicionamiento del miedo, para sincronizar los registros de Ca2+ con el comportamiento. La luz de excitación se entregó a 470 nm, mientras que se usó un canal de 415 nm como control isosbéstico. Las grabaciones se adquirieron a 40 FPS con los 2 canales activos en fotogramas alternos, lo que resultó en una velocidad de fotogramas efectiva de 20/s para cada canal. La potencia de la luz se calibró usando un fotómetro (Thor Labs PM100D) para que cada canal emitiera aproximadamente 50 μW. Durante las pruebas de comportamiento, el cable de conexión de fibra (Doric) se aseguró al implante de fibra del ratón con un collar de cerámica y el ratón no se molestó ni grabó durante 30 s después de la conexión del cable de conexión. Después de esto, se adquirió un registro de referencia de 5 minutos mientras el ratón se sentaba solo en una jaula de transferencia limpia con ropa de cama. La actividad locomotora no se registró durante este registro de referencia. En la marca de 5 min, los ratones se transfirieron al aparato de acondicionamiento del miedo para entrenamiento o prueba.

Para sincronizar los registros de fotometría con los datos de comportamiento, se envió un pulso TTL al sistema Neurophotometrics al inicio del protocolo ANY-maze. Las grabaciones de fotometría se analizaron utilizando scripts personalizados de MATLAB. La información de comportamiento registrada con ANY-maze se integró en el análisis indexando los datos de fotometría y alineando los datos de comportamiento en función de la diferencia mínima entre pares de marcas de tiempo. Los episodios de movimiento o inmovilidad que fueron más cortos que el criterio de congelación de 2 s no se incluyeron en el análisis. Los datos del canal isosbéstico de 415 nm se ajustaron a un decaimiento biexponencial para corregir el fotoblanqueo114. El vector resultante se utilizó para escalar linealmente los datos dependientes del calcio recopilados con un LED114 de 470 nm. Para calcular ΔF, estos datos dependientes del calcio escalados linealmente se restaron de los datos dependientes del calcio sin procesar sin procesar. Los valores resultantes se dividieron por los datos dependientes del calcio escalados linealmente para generar una traza de ΔF/F.

Para los análisis de ΔF/F, las trazas se corrigieron en la línea de base (Ec. 1). Esto se hizo para cada ratón calculando el valor medio de ΔF/F durante los 3 minutos centrales de la grabación de la jaula de 5 minutos. Este período se eligió como el período de referencia para reducir la probabilidad de que el manejo del estrés influya en el valor resultante. La diferencia entre el valor inicial medio de ΔF/F y el valor mínimo de ΔF/F registrado durante la sesión de prueba se sumó luego a cada valor durante la prueba. Esta corrección se aplicó para tener en cuenta las trazas en las que ΔF/F cayó por debajo del eje X durante la prueba. Las trazas de ΔF/F resultantes se analizaron para determinar el área bajo la curva (AUC), la frecuencia máxima y la altura media del pico. AUC se definió operativamente como el área sumada entre el eje X y la traza ΔF/F. Las comparaciones de AUC durante comportamientos específicos se normalizaron por la duración sumada de las épocas de comportamiento específico. Los análisis de la frecuencia máxima y la altura media de los picos emplearon un filtro de detección de picos de 2 desviaciones estándar por encima del valor medio de ΔF/F de la sesión analizada115.

donde hc es un vector que representa los valores de ΔF/F durante el período de muestreo de línea de base de la jaula doméstica, test es un vector que representa los valores de ΔF/F durante el período de prueba y n representa el número de muestras en el vector de prueba. La ecuación (1) representa el cálculo del ΔF/F corregido durante la sesión de prueba.

Los ratones Nestin-cre se sometieron a cirugía utilizando procedimientos quirúrgicos similares a los descritos anteriormente. Aquí, los virus AAV que expresan floxed channelrhodopsin (AAV1-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA) o GFP (pAAV1-Ef1a-DIO EYFP) se infundieron bilateralmente (0,25 µl) en la circunvolución dentada (AP— 1,94, ML ± 1,25, DV 1,8). Se implantaron sondas de fibra óptica como se ha descrito anteriormente. Luego se dejó a los ratones durante 2 semanas para permitir la recuperación y la expresión viral. Luego, a los ratones se les inyectó tamoxifeno, 180 mg/kg por día) durante 3 días consecutivos y luego se los dejó durante 2 semanas adicionales antes de comenzar los experimentos de comportamiento. Los ratones se entrenaron primero en el paradigma de condicionamiento del miedo contextual como se describe anteriormente. Luego, 24 h después del entrenamiento, los ratones recibieron estimulación optogenética con 0,4 mW, 10 Hz de luz azul durante 1 min, seguido de 3 min sin estimulación. Esto se repitió consecutivamente 5 veces por un total de 5 min de estimulación durante un período de 20 min. Este protocolo de estimulación se repitió diariamente durante 2 semanas. Un mes después del entrenamiento conductual y 2 semanas después de completar la estimulación optogenética, se analizó la memoria contextual del miedo en los ratones y luego se les perfundió.

Noventa minutos después de completar la tarea de condicionamiento contextual, los ratones se anestesiaron profundamente con isofluorano y luego se perfundieron transcardiacamente con PBS 0,1 M y formaldehído al 4%. Los cerebros se extrajeron y posfijaron en formaldehído al 4 % a 4 °C durante 24 h. Luego, los cerebros se crioprotegieron con sacarosa al 30 % en tampón de fosfato 0,1 M a 4 °C durante tres a cinco días hasta que se hundieron. Los cerebros se seccionaron con un grosor de 40 μm en un criostato (Leica CM 1950, Concord, ON, Canadá) en 12 series para el experimento c-Fos y en 6 series para el experimento de fotometría de fibra (para garantizar que las pistas de fibra pudieran ubicarse de manera confiable). ). Las secciones se mantuvieron en una solución anticongelante tamponada que contenía 30 % de etilenglicol y 20 % de glicerol en PBS 0,1 M y se almacenaron a -20 °C.

Las secciones de tejido se lavaron tres veces en PBS 0,1 M a temperatura ambiente durante diez minutos cada vez. A continuación, las secciones se incubaron durante 48 h en una solución de anticuerpo primario que contenía 1:500 de anticuerpo de cabra anti-DCX (c-18, sc-8066, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, Estados Unidos), suero de burro normal al 4 %, suero de burro normal al 0,4 % % de Triton X y 0,1 M de PBS para el experimento c-Fos o, para los experimentos de fotometría de fibra y PNN, 1:200 de anticuerpo anti-DCX de conejo (señalización celular, 4604 s), 3 % de suero normal de cabra y 0,003 % de Triton -X en 0,1 M PBS. Luego, las secciones se sometieron a tres lavados en PBS 0,1 M durante diez minutos antes de ser incubadas durante 24 h en una solución de anticuerpo secundario que contenía 1:500 de anticuerpo Alexa Fluor 488 (burro anti-cabra, CLAS10-1116, CedarLane Labs, Burlington, ON, Canadá ( o 1:500 Alexa Fluor 647 anticuerpo cabra anti-conejo). Finalmente, las secciones se incubaron con DAPI 1:5000 y PBS 0,1 M durante 20 minutos y luego se lavaron dos veces en PBS 0,1 M durante diez minutos por lavado. Para cada paso de lavado, solución de anticuerpos primarios/secundarios, o incubación DAPI, el tejido se osciló suavemente a temperatura ambiente.Luego, las secciones se montaron en portaobjetos de vidrio y se cubrieron con cubreobjetos No. 1.5H usando medio de montaje PVA-DABCO.

Las células marcadas con DCX se contaron en el granular y SGZ de la circunvolución dentada del hipocampo usando un microscopio epifluorescente Olympus BX63 y un objetivo de inmersión en aceite 60X. Se contaron las células si la célula era circular u ovular y el cuerpo celular podía distinguirse claramente. Se excluyeron las células con un patrón citoplasmático granular de fluorescencia. El área de DG se cuantificó en función de la contratinción DAPI al rastrear la capa de células granulares en cada sección usando FIJI.

Las secciones de tejido se lavaron tres veces en PBS 0,1 M y luego se transfirieron a una solución de anticuerpo primario que contenía 1:500 de anticuerpo anti-c-Fos de conejo (226003, Synaptic Systems, Gottingen, Alemania), suero de cabra normal al 4 %, Triton X al 0,4 %. y PBS 0,1 M durante 48 h. A continuación, las secciones de tejido se lavaron en PBS 0,1 M tres veces durante diez minutos antes de transferirlas a una solución de anticuerpo secundario durante 24 h. La solución de anticuerpo secundario contenía 1:500 de anticuerpo anti-conejo de cabra Alexa Fluor 488 (4412S, Cell Signaling Technologies, Danvers, MA, Estados Unidos) con 0,1 M de PBS. Finalmente, las secciones de cerebro se incubaron con DAPI 1:5000 y luego se lavaron dos veces en PBS 0,1 M. Para cada paso de lavado, solución de anticuerpo primario/secundario o incubación con DAPI, el tejido se osciló suavemente a temperatura ambiente. A continuación, las secciones se montaron y se cubrieron con un medio de montaje PVA-DABCO.

Se tomaron imágenes del tejido marcado con c-Fos utilizando un microscopio confocal Olympus FV3000. Todos los ajustes de adquisición se mantuvieron constantes en todas las imágenes. Las imágenes se adquirieron con un objetivo de 10X y un zoom óptico de 2X (ampliación total de 20X), con la apertura establecida en 1 unidad Airy. El tamaño de paso de las pilas Z fue de 3,64 μm. Las imágenes se separaron en canales DAPI y c-Fos y luego se proyectaron a máxima intensidad como una imagen 2D usando FIJI.

Para minimizar la variabilidad y el sesgo en nuestros recuentos de células c-Fos, validamos y utilizamos un enfoque basado en el aprendizaje automático (Fig. S1 complementaria), las microfotografías de células c-Fos + se segmentaron y convirtieron en una imagen binaria utilizando el programa de aprendizaje automático Ilastik116 y se cuantificaron. utilizando FIJI. Primero, se importó un conjunto de imágenes de entrenamiento que eran representativas de las imágenes experimentales a Ilastik, que luego se entrenó para distinguir la señal del fondo. Este conjunto de imágenes de entrenamiento permitió a Ilastik clasificar las celdas del fondo en función de las características de los píxeles, incluida la intensidad de los píxeles, las características de los bordes y las características de la textura y del objeto, como el tamaño, la forma y la intensidad del objeto. Después del entrenamiento, se cargaron en Ilastik ROI de muestra de 12 ratones (cinco sedentarios, siete corriendo) de las regiones DG, CA3 y CA1 para probar el programa. Para comparar los recuentos de células generados por Ilastik con los valores reales del terreno, cuatro investigadores independientes que tenían experiencia en la cuantificación de c-Fos también contaron manualmente los ROI, pero desconocían los recuentos generados por Ilastik, así como los recuentos de los otros experimentadores. . Los recuentos de células se sumaron para cada región y luego se compararon con los recuentos generados por Ilastik. Después del entrenamiento y la validación, las imágenes experimentales de c-Fos se procesaron por lotes. Las imágenes binarias se importaron a FIJI y se superpusieron con la imagen DAPI. Luego, las células se cuantificaron usando la imagen binaria y el área se midió usando FIJI. Luego se convirtió el área a mm2. Las células se cuantificaron dentro de las regiones DG, CA3 y CA1 y se expresaron como densidad (células por mm2).

Los PNN se marcaron mediante tinción con Wisteria Floribunda Lectina (WFA). Las secciones crioprotegidas se enjuagaron 3 veces en PBS 0,1 M y luego se incubaron en Triton-x al 0,2 % en tampón de bloqueo libre de carbohidratos (VectorLABS) durante 30 min. Luego, las secciones se tiñeron en una dilución 1: 1000 de WFA marcado con FITC (VectorLABS) diluido en 1 × tampón de bloqueo libre de carbohidratos que contenía 0.05% de tween-20 durante 24 h en la oscuridad. Luego, las secciones se enjuagaron 3 veces en PBS y se contrastaron con DAPI antes de montarlas y cubrirlas con medio de montaje vectashield (VectorLABS).

Las redes perineuronales marcadas con WFA se contaron manualmente en las zonas granulares de la circunvolución dentada, el área CA1 y el área CA3 del hipocampo. Los recuentos se realizaron usando un microscopio epifluorescente Olympus BX63 y un objetivo de inmersión en aceite 60X por un experimentador ciego a las condiciones del tratamiento. Las áreas de las zonas granulares de cada región se cuantificaron en base a la contratinción DAPI. Las capas de células granulares se rastrearon en cada región de cada sección usando CellSens (Olympus). Las células se cuantificaron dentro de las regiones DG, CA3 y CA1 y se expresaron como densidad (células por mm2).

La contigüidad de la superficie de las redes perineuronales CA1 se evaluó utilizando un microscopio confocal Olympus FV3000. Se recolectaron pilas de imágenes de 5 PNN seleccionados al azar en la zona granular del área CA1 de cada ratón. Las imágenes se adquirieron con un objetivo de 40X y un zoom óptico de 2,89X (ampliación total de 115,6X), con una apertura numérica de 0,95. El tamaño de paso de las pilas Z fue de 0,37 μm. Los parámetros de imagen fueron consistentes en todos los escaneos. Las pilas de imágenes se proyectaron con máxima intensidad como imágenes 2D utilizando FIJI con el rango Z configurado para abarcar solo la mitad superior de cada PNN. La señal WFA se binarizó en FIJI utilizando el umbral de intensidad de píxeles predeterminado y se rastrearon los PNN individuales. La contigüidad de la superficie se definió como la fracción de la señal WFA que reside dentro del componente conectado más grande de la señal WFA después del umbral de la señal117.

La expresión del virus y la ubicación de la fibra óptica fueron verificadas por un experimentador ciego a las condiciones del tratamiento y los resultados experimentales. La expresión del virus en CA1 estaba presente en todos los ratones. Se eliminaron dos ratones de control y tres corredores del experimento de fotometría porque la punta de la fibra óptica estaba colocada debajo de CA1.

El análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism 8. Se realizaron pruebas t independientes, ANOVA de dos vías y correlaciones de Pearson. Se aplicaron pruebas post hoc Newman-Keuls post-hoc siguiendo ANOVA cuando fue apropiado. El análisis de Grubbs se utilizó para identificar posibles valores atípicos en los datos de validación de Ilastik. La prueba de hipótesis se complementó con estadísticas de estimación para la cuantificación de c-Fos utilizando estimationstats.com118. Se utilizó un análisis múltiple de dos grupos para la expresión de c-Fos. Para cada comparación de dos grupos, el tamaño del efecto (d de Cohen) se calcula utilizando una distribución de muestreo de arranque utilizando 5000 remuestreos junto con un intervalo de confianza del 95,0 % (IC; sesgo corregido y acelerado). Los datos se trazan mediante gráficos de estimación de Cumming para análisis de dos grupos múltiples que muestran puntos de datos individuales y el tamaño del efecto de las comparaciones. Se realizaron análisis de poder basados ​​en datos de comportamiento de estudios previos de olvido inducido por neurogénesis10. Se estimó que los tamaños de muestra de 10 a 15 daban una potencia de ~ 0,8 a 0,9. Todas las comparaciones y resultados estadísticos se incluyen en las tablas complementarias S1-S6.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el manuscrito o materiales complementarios, y están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

Todo el código de análisis utilizado para generar los resultados informados en el manuscrito, las instrucciones sobre cómo usar estos análisis y los conjuntos de datos de muestra se han puesto a disposición del público en un repositorio de GitHub (https://github.com/dterstege/PublicationRepo/tree/main/ Evans2022).

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El financiamiento para este estudio fue proporcionado por una subvención NSERC Discovery Grant (RGPIN-2018-05135) a JRE y una subvención de desarrollo de capacidad de investigación Brain Canada Early Career (4709) a JRE. DJT recibió una beca de la Canadian Open Neuroscience Platform. GAS recibió becas PDF de NSERC, Hotchkiss Brain Institute y Cumming School of Medicine.

Estos autores contribuyeron por igual: Alexandria Evans y Dylan J. Terstege.

Departamento de Biología Celular y Anatomía, Hotchkiss Brain Institute, Cumming School of Medicine, HMRB 162, Health Sciences Center, University of Calgary, 3330 Hospital Drive NW, Calgary, AB, T2N 4N1, Canadá

Alexandria Evans, Dylan J. Terstege, Gavin A. Scott, Mio Tsutsui y Jonathan R. Epp

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AE, DJT y JRE concibieron y diseñaron los experimentos. AE, DJT y GAS realizaron los experimentos. GAS y MT realizaron los procedimientos quirúrgicos. AE, DJT, GAS y JRE realizaron los procedimientos histológicos. AE, DJT y JRE realizaron los análisis. AE, DJT y JRE escribieron el artículo.

Correspondencia a Jonathan R. Epp.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Evans, A., Terstege, DJ, Scott, GA et al. La plasticidad mediada por neurogénesis se asocia con una actividad neuronal reducida en CA1 durante la recuperación de la memoria del miedo contextual. Informe científico 12, 7016 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-10947-w

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Recibido: 10 enero 2022

Aceptado: 14 abril 2022

Publicado: 29 abril 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-10947-w

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