Las intervenciones optogenéticas y farmacológicas vinculan las neuronas de hipocretina con la impulsividad en ratones

Jun 30, 2023

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 74 (2023) Citar este artículo

Las neuronas en el hipotálamo lateral que expresan el neuropéptido hipocretina, también conocido como orexina, son moduladores críticos conocidos de la estabilidad de la excitación. Sin embargo, su papel en los diferentes componentes del constructo de excitación, como la atención y la toma de decisiones, es poco conocido. Aquí estudiamos la dinámica del circuito neuronal de hipocretina durante la impulsividad de acción de parada en una tarea Go/NoGo en ratones. Mostramos que la actividad neuronal de hipocretina se correlaciona con la anticipación de la recompensa. Luego evaluamos el papel causal de la actividad neuronal de la hipocretina usando optogenética en una tarea Go/NoGo. Mostramos que la estimulación de las neuronas de hipocretina durante el período de señal aumenta drásticamente el número de respuestas prematuras. Estos efectos son mimetizados por la anfetamina, reducidos por la atomoxetina, un inhibidor de la captación de norepinefrina, y bloqueados por un antagonista selectivo del receptor de hipocretina 1. Concluimos que las neuronas de hipocretina tienen un papel clave en la integración de estímulos destacados durante la vigilia para producir respuestas apropiadas y oportunas a señales gratificantes y aversivas.

Las Hipocretinas (Hcrts), también conocidas como orexinas, son dos neuropéptidos derivados del mismo precursor1,2. Las neuronas que producen péptidos Hcrt están restringidas al área hipotalámica lateral, pero sus proyecciones se extienden ampliamente por todo el cerebro3. Estudios previos han demostrado que la integridad del sistema Hcrt es esencial para la estabilidad de la excitación; la pérdida de neuronas Hcrt en perros, ratones y humanos da como resultado narcolepsia con cataplejía. Se cree que esta estabilidad se ejerce mediante la integración de múltiples variables de las conexiones hipotalámicas locales, así como aferentes del hipocampo, el tabique y la amígdala4.

Además del papel demostrado en las transiciones del estado de excitación, múltiples líneas de evidencia han colocado al sistema hipocretina/orexina como un importante relevo en el procesamiento de la recompensa cerebral5,6. Nosotros y otros demostramos que el antagonismo de Hcrt R reduce la motivación para buscar una recompensa7 y bloquea el restablecimiento del estrés de la búsqueda de cocaína8,9. Es probable que este efecto se deba a un aumento duradero de la excitabilidad dopaminérgica provocada por la liberación de Hcrt10,11,12 a través de la señalización de HcrtR113,14.

La impulsividad, a menudo definida como una acción sin previsión ni consideración por las consecuencias, es una característica esencial de numerosas afecciones psiquiátricas, incluidas la adicción y el trastorno bipolar15,16. Una característica común importante de la excitación y la adicción reside en la integración de señales destacadas para tomar decisiones apropiadas orientadas a objetivos. Anteriormente mostramos que la actividad de las neuronas Hcrt se correlaciona con la exposición a estímulos de valencia tanto positiva como negativa17,18. Sin embargo, se desconoce si la actividad Hcrt provocada por esos estímulos tiene algún efecto sobre la toma de decisiones. Aquí hemos estudiado el papel de la actividad Hcrt en la toma de decisiones y la impulsividad de acción mediante la modulación del sistema Hcrt utilizando farmacología y optogenética durante una tarea Go/NoGo establecida.

Usamos fotometría de fibra para monitorear la actividad de las neuronas Hcrt en una tarea Go/NoGo. Entrenamos ratones Hcrt-IRES-cre knockin18 en la tarea Go/NoGo hasta un 70% de precisión, infundimos un vector viral que codifica GCamp6f e implantamos una fibra óptica en el hipotálamo lateral (Fig. 3 complementaria). Registramos la actividad neuronal de Hcrt a lo largo de la tarea Go/NoGo y el cambio de señal analizado fuera de línea durante las transiciones entre las fases de la tarea (Precue, Go y NoGo Cues, Reward, ITI). Como se muestra en las Fig. 1A y D, las respuestas de calcio tendieron a aumentar en la transición de la preseñal a los períodos de señal, particularmente en los animales que respondieron correctamente a la señal Go (interacción de tiempo x transición F(1,4) = 2,69, p = 0,10 ). Los trazos de Go correctos fueron significativamente diferentes de los de Precue (Fig. 1D; p = 0,03). Esta señal contrasta con los bajos niveles de actividad observados durante el período NoGo Cue (Fig. 1B). Los animales que tenían respuestas incorrectas mostraron diferencias moderadas pero significativas en las señales de calcio tras la exposición a la señal, en consonancia con una respuesta a los estímulos destacados18. Las señales de calcio aumentaron progresivamente durante el período Go Cue y alcanzaron niveles máximos coincidentes con la entrega de una recompensa (Fig. 1B) (Tiempo F(1,4) = 9,27, p = 0,04). Por el contrario, el perfil de actividad del calcio de las neuronas Hcrt se mantuvo bajo durante la señal NoGo, pero también mostró un pico inmediatamente después del nosepoke. La transición de la recompensa al final de la prueba en el período de intervalo entre pruebas también mostró un pico en la actividad (Fig. 1C, F) (Tiempo F (1,4) = 7.88, p = 0.048), pero ambos correctos Los grupos Go y NoGo mostraron respuestas similares (Tiempo x Transición F(1,4) = 0,007, p = 0,94). No se detectó señal fluorescente en ratones de tipo salvaje (Hcrt-IRES-cre-) (Fig. 1 complementaria).

Media ΔF/F de las neuronas Hcrt 5 s antes y 5 s después (A, D) Precue to Cue, (B, E) Cue to Reward, o (C, F) Reward to ITI transiciones en la tarea Go/NoGo. A–C Time 0 y la línea punteada vertical indican el punto de transición. El tono de color denota la respuesta de los animales en la tarea Go/NoGo. La región sombreada representa SEM La fila inferior (D–F) muestra la señal media durante 1 s antes y 1 s después de la transición etiquetada arriba. * indica diferencia entre grupos (prueba de Bonferroni, p < 0,05).

Para determinar si el pico de actividad de Hcrt fue causal de la acción impulsiva, utilizamos la estimulación optogenética de las neuronas Hcrt durante los primeros 5 s de las señales Go y NoGo. Elegimos parámetros que son consistentes con grabaciones in vivo de neuronas Hcrt19 a 5 y 10 Hz. La estimulación durante la señal de Go no afectó significativamente el número de respuestas (P > 0,05) (Fig. 2A). Sin embargo, la estimulación Hcrt durante la señal NoGo redujo drásticamente la probabilidad de pruebas NoGo correctas (p < 0,001 RM-ANOVA con comparaciones múltiples de Bonferroni) (Fig. 2B; Películas complementarias 1 y 2). Curiosamente, la estimulación optogenética de Hcrt durante el período previo a la señal también aumentó las respuestas prematuras en animales Hcrt-cre pero no en ratones de control de tipo salvaje (P> 0.05, RM-ANOVA) (Fig. 2C). Estos resultados sugieren fuertemente que las neuronas Hcrt responden a señales destacadas asociadas con una recompensa, y la actividad se suprime si se requiere la inhibición del comportamiento.

Los efectos de la estimulación optogenética de 5 o 10 Hz de las neuronas Hcrt en el comportamiento Go/NoGo. Una estimulación Hcrt no tiene efecto sobre la probabilidad de una respuesta Go correcta, pero (B) reduce la probabilidad de una respuesta NoGo correcta y (C) aumenta la tasa de respuesta previa. Los efectos no se ven en los controles Hcrt-cre- (gris). El color indica el genotipo y la sombra indica la frecuencia del láser. * indica la diferencia con los ensayos de control sin láser dentro del mismo genotipo (prueba de Bonferroni, p < 0,05) y † indica la diferencia con los controles Hcrt-cre- a esa frecuencia de láser en particular. Los diagramas de caja indican los promedios y la desviación estándar. Los bigotes abarcan valores máximos y mínimos.

Hcrt ejerce su acción sobre dos GPCRS que se unen diferencialmente a Hcrt1 y Hcrt2. Los estudios en animales knockout indican que tanto la señalización de HcrtR1 como la de HcrtR2 afectan la estabilidad del sueño/vigilia20, mientras que HcrtR1 modula los efectos sobre la función de recompensa cerebral21. Por lo tanto, utilizamos un antagonista selectivo de HcrtR1 para probar si la señalización de HcrtR1 es necesaria para el efecto de Hcrt sobre la impulsividad.

Para calibrar el efecto de los antagonistas de HcrtR1, evaluamos las respuestas de los animales en la tarea Go/NoGo después de inyecciones de diferentes dosis de anfetamina (Figs. 3A, D, G), (1 y 2,5 mg administrados 10 min antes del ensayo, un psicoestimulante conocido por aumentar la elección impulsiva 22 o atomoxetina (Fig. 3B, E, H), un inhibidor de la recaptación de noradrenérgicos que mejora el rendimiento en la tarea Go/NoGo 23. De hecho, el tratamiento con anfetamina, dependiente de la dosis, redujo la probabilidad de NoGo (P < 0,05 RM- ANOVA) (Fig. 3D), mientras que la atomoxetina mejoró ligeramente el rendimiento de los ratones (P < 0,05 RM-ANOVA) (Fig. 3B, H). De manera similar a la atomoxetina, el antagonista selectivo de HcrtR1 aumentó en función de la dosis la probabilidad de No Go y redujo la Tasa de respuesta Pre-Cue (P < 0.05 RM-ANOVA) (Fig. 3F, I).

La anfetamina disminuye la tasa de respuesta NoGo correcta (D) y aumenta la tasa de respuesta PreCue (G), pero no altera la tasa de respuesta Go correcta (A). Por el contrario, la atomoxetina aumenta la tasa de respuesta correcta de Go (B) y disminuye la tasa de respuesta de PreCue (H), pero no altera la tasa de respuesta correcta de NoGo (E). El antagonismo selectivo de HcrtR1 disminuye la tasa de respuesta correcta Go (C) y la tasa de respuesta PreCue (I) y aumenta la tasa de respuesta correcta NoGo (F). Los datos del vehículo se comparten entre los grupos de anfetamina y atomoxetina (suministrados IP), mientras que los datos del antagonista de HcrtR1 se comparan con el vehículo administrado en la misma modalidad (alimentación oral). * indica la diferencia entre el tratamiento con el vehículo (prueba de Bonferroni, p < 0,05). Los diagramas de caja indican los promedios y la desviación estándar. Los bigotes abarcan valores máximos y mínimos.

Luego comparamos las respuestas operantes en un paradigma Go/NoGo después de la estimulación optogenética con Hcrt y el tratamiento farmacológico sistémico con anfetamina (Fig. 4A, D, G), atomoxetina (Fig. 4B, E, H) o un antagonista selectivo de HcrtR1 (Fig. 4C, F, I). La probabilidad de respuestas prematuras durante el período preCue aumentó con la administración sistémica de anfetamina, de manera similar a la estimulación neuronal Hcrt (Fig. 4G) (P < 0,05 efectos principales del tratamiento, genotipo en RM-ANOVA de dos vías). Por el contrario, el tratamiento con atomoxetina, un inhibidor de la captación de noradrenérgicos conocido por aumentar la atención y disminuir la impulsividad24, recuperó parcialmente los efectos de la fotoestimulación Hcrt (Fig. 4E, H) (P < 0,05 efectos principales e interacción del tratamiento y el genotipo en RM bidireccional -ANOVA). El antagonista de HcrtR1 recuperó por completo el aumento de las respuestas prematuras provocadas por la estimulación con Hcrt (Fig. 4F) (P < 0,05 efectos principales e interacción del tratamiento y el genotipo en RM-ANOVA de dos vías).

Los efectos de la estimulación con Hcrt de 10 Hz junto con la administración de anfetamina (A, D, G), atomoxetina (B, E, H) o antagonista de HcrtR1 (C, F, I) en varias dosis en la tasa de respuesta correcta de Go (A, B, C, estimulación entregada durante los primeros 5 s del Período de Cue Go), tasa de respuesta NoGo correcta (D, E, F, estimulación entregada durante los primeros 5 s del Período Cue NoGo) y tasa de respuesta PreCue (G, H, I, estimulación administrada durante los últimos 5 s del Período PreCue). El color indica el genotipo (púrpura para hcre-cre+ y gris para los controles) y el tono indica la dosis (más oscuro para dosis más altas). Los datos del vehículo se comparten entre los grupos de anfetamina y atomoxetina (suministrados IP), mientras que los datos del antagonista de HcrtR1 se comparan con el vehículo administrado en la misma modalidad (alimentación oral). *indica la diferencia del vehículo dentro del mismo genotipo (prueba de Bonferroni, p < 0,05); † indica la diferencia con respecto a los controles Hcrt-cre- a esa dosis en particular (prueba de Bonferroni, p < 0,05).

La impulsividad, que conduce a una toma de decisiones deteriorada, se asocia con muchos trastornos psiquiátricos y del comportamiento, como el trastorno por déficit de atención/hiperactividad, los trastornos alimentarios y por abuso de sustancias25,26,27. Múltiples estudios han establecido una relación entre el consumo de cafeína, la pérdida de sueño, las conductas de riesgo y la impulsividad28,29, aunque se desconocen los mecanismos neuronales de dichas relaciones. La Ley de Yerkes-Dodson establece que existe una relación entre la excitación fisiológica y el rendimiento hasta cierto punto, donde un exceso de excitación conduce a un bajo rendimiento. De hecho, existe evidencia de que la hipoactivación en pacientes narcolépticos con deficiencia de Hcrt produce déficit de atención30. Aquí usamos una tarea Go/NoGo para evaluar el rendimiento y el comportamiento de impulsividad motora en ratones y probamos si la excitación impulsada por el neuropéptido Hcrt seguía la Ley de Yerkes-Dodson. Mostramos que la hiperexcitación inducida por la estimulación optogenética de las neuronas Hcrt a frecuencias consistentes con su perfil de actividad fásica31,32 también disminuye el rendimiento de la atención.

El aumento de la impulsividad causado por la actividad de Hcrt es consistente con otros informes que muestran una disminución de la impulsividad por la cocaína tras el tratamiento con suvorexant, un antagonista dual de HcrtR33. Las neuronas Hcrt parecen ser activadas por una plétora de estímulos destacados de valencias tanto positivas como negativas17,18. Por lo tanto, la actividad de Hcrt puede interpretarse como una señal de alerta/emergencia que activa rápidamente los circuitos de excitación monoaminérgicos. Usando cFos, Freeman et al. 34 mostró la activación de las neuronas Hcrt hipotalámicas mediales, pero no las laterales, correlacionadas con mayor precisión en la tarea Go/NoGo. La mala resolución temporal de la inmunorreactividad de cFos (60 min después de la sesión Go/NoGo) impide realizar comparaciones directas con nuestros estudios. Una limitación de nuestros resultados es que no se pudo verificar anatómicamente la ubicación exacta de la cánula debido a la mala calidad del tejido. Sin embargo, probamos la ubicación precisa antes de los experimentos optogenéticos al monitorear las transiciones de sueño/vigilia después de una estimulación de 10 Hz. Este método demostró ser extremadamente fiable en nuestro trabajo anterior17. También verificamos la precisión de las condiciones de inyección y la expresión eutópica de los transgenes en animales nuevos (Fig. 2 y 3 complementarias).

¿Qué mecanismo impulsa la impulsividad provocada por las neuronas Hcrt? El circuito neuronal que subyace a Go/NoGo se ha asociado con la integridad funcional y estructural de los sistemas cerebrales que se sabe que están comprometidos en la dependencia de drogas estimulantes en humanos35,36 y roedores26,27. La capacidad de inhibir las acciones después de que se haya formado un hábito se ha relacionado clásicamente con los bucles neuronales entre el área tegmental ventral (VTA) y la cubierta del núcleo accumbens (NAcc), así como con los bucles corticostriatales. Sin embargo, aún no se comprende bien cómo estas estructuras son moduladas por la excitación y la atención. Las interacciones entre la capa NAcc y el VTA se han propuesto como el sustrato principal de la impulsividad de espera, por lo que las neuronas VTA se proyectan a las células GABAérgicas en la capa NAcc, que se proyectan de regreso a las interneuronas GABA en el VTA. La respuesta prematura impulsiva se asocia con una menor liberación de dopamina en el núcleo y una mayor liberación de dopamina en la subregión de la cubierta37. Evidencia sustancial muestra conexiones recíprocas entre Hcrt, neuronas que contienen el receptor D2 en el caparazón NAcc y el VTA. Hcrt1 aumenta la activación de las neuronas de capa lateral y medial de NAcc38. Recientemente González et al. 39, mostró que las neuronas Hcrt aumentaron la actividad durante el acercamiento a la comida, y esta actividad disminuyó a la línea de base al comienzo del comportamiento consumatorio, mediado por interacciones recíprocas entre la cubierta de la NAcc y las neuronas Hcrt. Las respuestas de Go correctas reducidas observadas después del tratamiento con un antagonista de Hcrt R1 (Fig. 2C) son poco probables debido al aumento de la somnolencia20, ya que los ratones knockout para Hcrt R1 tienen un fenotipo de sueño leve; en cambio, estos ratones indican que HcrtR1 es necesario para la respuesta, la motivación o ambas cosas21. Blomeley et al. 40 describieron un circuito excitador Hcrt→D2 directo y demostraron que la actividad de las células D2 es necesaria para evitar el riesgo innato dependiente de Hcrt en ratones40. Dynorphin, que es co-liberado por Hcrt+ en la LH, inhibe la mayoría de las neuronas dopaminérgicas que proyectan la capa medial de NAcc y la amígdala basolateral, pero reduce la descarga solo en una pequeña fracción de aquellas que se proyectan a la capa lateral de NAcc. Se ha sugerido que la activación de los receptores opioides Kappa aumenta la impulsividad en el 5CSRRT41. Nuestra estimulación optogenética de las neuronas Hcrt puede haber aumentado la liberación de Dynorphin42,43. Por lo tanto, es concebible que los cambios en la relación E/I provocados por la liberación de Hcrt en la capa de NAcc puedan provocar respuestas prematuras al unirse a los receptores de Hcrt en las neuronas D2 o en las interneuronas NPY+. Es de destacar que el efecto neuromodulador de Hcrt en el NAcc parece ser específico, ya que la activación quimiogenética de las neuronas del VTA no afecta la impulsividad44,45. La actividad de Hcrt también puede cambiar el equilibrio E/I de las salidas hipotalámicas: la excitación de la neurona LH(GAD65) induce una actividad locomotora elevada, mientras que la inhibición de la actividad natural de la neurona LH(GAD65) deprime la locomoción voluntaria46. Por lo tanto, el circuito Hcrt → LH(GAD65) puede ayudar a crear el impulso para ejecutar, lo que se refleja en el ensayo Go/NoGo como un aumento de las respuestas prematuras.

Además del circuito canónico VTA→ NAcc shell, la estimulación optogenética Hcrt activa el locus coeruleus (LC)47, una estructura también involucrada en el comportamiento impulsivo mediado por la liberación de noradrenalina en la corteza prefrontal (PFC)48 o el NAcc49. La liberación de norepinefrina (NE) en el caparazón de NAcc juega un papel importante en los efectos de la atomoxetina sobre la impulsividad, mientras que la NE en el PFC atenúa los efectos de la anfetamina en el comportamiento impulsivo. Dado que la estimulación optogenética de Hcrt no cambió los efectos de la anfetamina sobre la impulsividad, la NE parece modular la acción de Hcrt en el NAcc.

Usando fotometría de fibra, hemos demostrado que la actividad neuronal de Hcrt en el hipotálamo lateral alcanza su punto máximo en el momento de entregar una recompensa en las pruebas de Go, en consonancia con el 74 % de las neuronas que aumentan su tasa de activación en los registros globales de una tarea de elección50. Estudios recientes de Burdakov et al. 46 y nuestro propio laboratorio17 indican que las neuronas Hcrt son sensibles a múltiples estímulos destacados y que el aumento de la concentración de Ca2+ durante la sesión de Go puede reflejar tal prominencia (fig. 1). Se observaron perfiles fotométricos similares al registrar las respuestas de las neuronas noradrenérgicas TH+ en el Locus coeruleus, una estructura cerebral críticamente involucrada en la atención. El trabajo previo de nuestro laboratorio mostró que las neuronas Hcrt se proyectan densamente a LC y que el bloqueo optogenético de la actividad neuronal de LC previene las transiciones de sueño a vigilia inducidas por Hcrt47. Los perfiles de fotometría de las neuronas Hcrt y LC también fueron similares cuando se registraron durante las pruebas NoGo correctas y durante las respuestas prematuras en las sesiones NoGo. Es probable que la conexión HcrtLC se señalice a través de los receptores HcrtR1 en función de su patrón de expresión informado en el LC51,52. En consecuencia, los antagonistas de HcrtR1 pudieron reducir las respuestas prematuras provocadas por la anfetamina.

El TDAH se caracteriza por un nivel de falta de atención, impulsividad y/o hiperactividad inapropiado para el desarrollo, y se han utilizado atomoxetina y otros estimulantes para tratar a adultos con este trastorno53. De hecho, aquí mostramos que la atomoxetina, un inhibidor de la captación de noradrenérgicos, restaura parcialmente las respuestas normales después de la impulsividad provocada por la estimulación Hcrt optogenética. Un antagonista selectivo de Hcrt R1 pareció más eficaz para rescatar la probabilidad de comportamiento inhibitorio en la prueba de impulsividad, lo que sugiere una posible aplicación clínica en el tratamiento de trastornos psiquiátricos con impulsividad desadaptativa.

Aquí hemos demostrado una relación causal entre la activación de las neuronas Hcrt y la impulsividad de espera y detención. La estimulación optogenética de las neuronas Hcrt aumentó las respuestas prematuras en los ensayos NoGo, mientras que un antagonista selectivo de HcrtR1 redujo el efecto de la anfetamina en una tarea Go/NoGo. Es probable que este efecto esté mediado por mecanismos dopaminérgicos y noradrenérgicos en el cuerpo estriado y la CPF. La solidez y especificidad de los antagonistas de HcrtR1 en esta tarea los convierte en excelentes herramientas farmacológicas para tratar el TDAH y otros trastornos asociados con la impulsividad.

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas de la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. y fueron aprobados por el Panel Administrativo de Cuidado de Animales de Laboratorio de la Universidad de Stanford (protocolo ID # 18787).

Los animales recibieron cada fármaco/dosis en un orden aleatorio para protegerlos contra los efectos del orden, con al menos 3 días entre los días de tratamiento para permitir un lavado suficiente. El clorhidrato de atomoxetina se obtuvo de Sigma (Y0001586) y se disolvió en NaCl al 0,9 % (solución salina) que se administró mediante una inyección intraperitoneal a una dosis de 5 mg/kg o 10 mg/kg 30 min antes del inicio de la prueba Go/NoGo. prueba. El hemisulfato de D-anfetamina se obtuvo de Sigma (A5880 y se disolvió en NaCl al 0,9 % (solución salina) que se administró mediante inyección intraperitoneal a una dosis de 1 mg/kg o 2,5 mg/kg 10 min antes del inicio del Go/ Prueba NoGo22,54). Además, se obtuvo un antagonista de HcrtR1 de Boehringer Ingelheim (patente WO2017/178339) y se disolvió en hidroxietilcelulosa al 0,5 % (Sigma, 525944) y Tween 80 al 0,015 % (Sigma, P1754) en agua que se administró por sonda oral a una dosis de 2,5 mg/kg, 7,5 mg/kg o 12,5 mg/kg. Además de los 7 grupos de fármaco/dosis, se incluyeron dos grupos de control en los que los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de solución salina 10 minutos antes del inicio de la prueba Go/NoGo o recibieron la solución vehículo utilizada para administrar el compuesto HcrtR1 por vía oral. sonda 60 min antes del inicio de la prueba Go/NoGo.

Se criaron en casa ratones heterocigotos macho Hcrt-IRES-Cre knock-in (Hcrt-cre+) retrocruzados sobre fondo C57BL6J (N9), con compañeros de camada de tipo salvaje (Hcrt-cre-) usados ​​como controles. Los ratones se alojaron en grupos de hasta cinco ratones en cámaras de plexiglás con temperatura estable (22 ± 1 ˚C), humedad (40–60 %) y condiciones de iluminación (9:00 a. m. a 9:00 p. m. oscuridad; 9: 00 pm–9:00 am luz). En el momento del comienzo del entrenamiento, los ratones pesaban ~27 g. Durante el entrenamiento, los ratones pasaron a un paradigma de restricción de agua, en el que se les dio acceso al agua durante 2 a 4 h al final de su período activo. Todo el entrenamiento, grabación y manipulaciones ocurrieron durante el período oscuro.

Los ratones se anestesiaron con una mezcla de ketamina (100 mg/kg) y xilazina (20 mg/kg) y se montaron en un marco estereotáxico animal (David Kopf Instruments) y recibieron inyecciones de 0,3 μl AAV-DJ-EF1α-DIO-hChR2( H134R)-virus eYFP (2,5 × 1012 copias del genoma por ml, Stanford Virus Core) en el hipotálamo lateral derecho o izquierdo (LH) (AP: − 1,35 mm, ML: ± 0,95 mm, DV: −5,15 mm) con un 5 microjeringa Hamilton μl. Se implantó una fibra de vidrio (200 μm de diámetro, Doric Lenses, Franquet, Québec, Canadá) con la punta justo encima del sitio de inyección para estimulaciones optogenéticas. Para la fotometría de fibra, se administraron 0,3 μl de vectores AAV que portan genes que codifican GCaMP6f (AAV-DJ-EF1α-DIO-GCaMP6f, 1,1 × 1013 copias del genoma por ml, Stanford Virus Core) a la LH derecha o izquierda (AP: −1,35 mm, ML: ± 0,95 mm, DV: −5,15 mm) con una microjeringa Hamilton de 5 μl y se implantó una fibra de vidrio (400 μm de diámetro, 0,48 NA, lentes dóricas) con la punta en el sitio de inyección para la posterior adquisición de la señal GCaMP6f . Los ratones Hcrt-cre+ y Hcrt-cre- (control) recibieron un tratamiento viral idéntico.

Primero, se entrenó a los animales para que aprendieran dónde se produce la entrega de la recompensa mediante un programa de intervalos aleatorios de 60 s hasta que investigaran de manera confiable el puerto de recompensa de los pinchazos en la nariz (>200 pinchazos en la nariz por sesión) y los pinchazos en la nariz fiables durante el período de recompensa ( hasta que ~80% de los períodos de recompensa mostraron al menos un golpe en la nariz). Después de esto, los ratones fueron entrenados en 'Go Cue' en una sesión de 40 minutos o 60 ensayos (lo que ocurriera primero) de solo ensayos de Go Cue. Una vez que los ratones respondieron de manera confiable a Go Cue (>70 % de respuesta precisa a Go Cue durante tres días de entrenamiento consecutivos), se introdujo la 'NoGo Cue' para que la sesión de prueba de 40 min/60 fuera una distribución aleatoria del 50 % de pruebas de Go y 50% de ensayos NoGo. Una vez que los ratones respondieron de forma fiable y precisa a las señales Go y NoGo (>70 % de respuestas correctas a las señales durante tres días de entrenamiento consecutivos), se consideró que los ratones estaban listos para la prueba. Se mantuvo una precisión confiable entre los días de prueba con entrenamiento regular (al menos 5 días a la semana); los ratones solo se evaluaron si su sesión de entrenamiento más reciente mostró una precisión >70 % en las señales Go y NoGo (Fig. 5).

Después de un período de Precue de duración variable (duración de 9 a 24 s, luz de la jaula encendida), los períodos Go y NoGo (duración de 10 s o hasta que se asome la nariz, luz de la jaula encendida) se señalan al animal a través de una señal auditiva distinta. ITI significa intervalo entre pruebas (duración 10 s, luz de la jaula apagada). Las respuestas prematuras durante el período Pre-cue y las respuestas incorrectas durante el período Cue desencadenan la progresión al ITI, al igual que la conclusión del período de recompensa (duración 3 s, luz de la jaula encendida). Los recuadros sombreados indican respuestas incorrectas.

Se calcularon los siguientes parámetros por sesión: Aciertos: el número de veces que un animal produce un golpe en la nariz durante el período de referencia de una prueba de Go en una sesión particular; Falsas alarmas: el número de intentos de NoGo en los que el animal se pinchó la nariz durante el período de señal de NoGo; Tasa de respuesta de PreCue: el número total de respuestas realizadas durante todos los períodos de pre-cue y se divide por la duración total de todos los períodos de pre-cue. Si no se produjo ningún poke durante la presentación de la señal, el valor se establece en la latencia máxima (tiempo máximo de presentación de la señal).

Para una grabación de fotometría de fibra, los ratones Hcrt-cre+ y Hcrt-cre- se conectaron a un cable de grabación flexible y se colocaron en la cámara operante. Allí, su señal de GCaMP6f se registró durante 12 min, 1 min de registro de línea de base mientras el ratón descansaba en la jaula operante sin ejecutar ninguna tarea, y luego 10 min de ensayos Go/NoGo (proporción 50:50 de ensayos Go a NoGo) , seguido de un minuto adicional de grabación posterior a la sesión. Las grabaciones se capturaron utilizando el equipo descrito anteriormente55,56. Brevemente, la luz de excitación de 470 nm (M470F3, Thorlabs, NJ, EE. UU.) se moduló sinusoidalmente a 211 Hz usando un programa Matlab personalizado (MathWorks, Natick, MA, EE. UU.) y un dispositivo de adquisición de datos multifunción (NI USB-6259, National Instruments, Austin, Texas, EE. UU.). La luz de excitación pasó a través de un filtro de excitación GFP (MF469-35, Thorlabs) y se reflejó en un espejo dicroico (MD498, Thorlabs) en un latiguillo de baja fluorescencia (400 µm, 0,48 NA; lentes dóricas) a través de un paquete de colimación de fibra (F240FC -A, Thorlabs). El latiguillo se conectó a la fibra óptica implantada del animal a través de un manguito de zirconio (SLEEVE_ZR_2.50, Doric Lenses). La fluorescencia de GCaMP6f se recolectó a través del cable de conexión y se pasó a través de un filtro de emisión GFP (MF525-39, Thorlabs) y se enfocó en un fotodetector (LA1540-A, Thorlabs; Modelo 2151, Newport, Irvine, CA, EE. UU.). Luego, la señal se envió a un amplificador lock-in (constante de tiempo de 30 ms, modelo SR830, Stanford Research Systems, Sunnyvale, CA, EE. dispositivo de adquisición (National Instruments). Las señales de GCaMP6f se alinearon con los comportamientos en la cámara operante a través de pulsos TTL enviados desde la cámara operante y se registraron en un flujo de datos paralelo a través de un script Matlab personalizado. Para cuantificar el cambio de las señales de GCaMP6f, los valores antes de las transiciones de estado se promediaron como la línea de base, y el tamaño del área (ΔF/F integral) entre la línea de base y el rastro de la señal de GCaMP6f se determinó y promedió para cada ratón individual.

Para examinar el efecto de estimular las neuronas Hcrt a través de la tarea Go/NoGo, los ratones Hcrt-cre+ y Hcrt-cre- se conectaron mediante un cable de conexión de fibra óptica a un láser. La intensidad de la luz se calibró a 10 mW en la punta con un fotómetro (Thorlabs). Luego, se conectó el latiguillo de fibra óptica (MFP_200/240/900-0.22_3.0m_FC-MF2.5, lentes Doric) al implante de fibra de vidrio a través de una manga de zirconio (SLEEVE_ZR_2.50, lentes Doric). Para verificar la ubicación de las fibras, se confirmó que los animales se despertaron (iniciaron el movimiento) dentro de los 20 s de la estimulación (5 s a 5 Hz, 10 ms de ancho de pulso, 10 mW) administrada durante un comportamiento similar al sueño sostenido (más de 30 segundos), como se informó en otro lugar57 ,58. Dado que la integridad del tejido se vio comprometida en el tejido no fijado, la localización anatómica de la cánula se verificó post mortem en un grupo separado de animales (ver la Fig. 2 complementaria). Después de habituarse al aparato Go/NoGo con conexión de fibra óptica, se realizó estimulación optogenética con frecuencias variables en diferentes puntos durante las pruebas Go/NoGo (intensidad de luz en la punta de la fibra: 10 mW, ancho de pulso de luz: 15 ms; 5 y 10 Hz se realizó estimulación durante 5 s). El momento de la estimulación con láser se distribuyó aleatoriamente entre 4 condiciones de prueba: (1) sin estimulación con láser; (2) estimulación láser durante los últimos 5 s del Período PreCue; (3) estimulación láser durante los primeros 5 s del Período Go Cue; y (4) estimulación con láser durante los primeros 5 s del período de señal NoGo. Los parámetros de estimulación optogenética se seleccionaron en base a validaciones previamente informadas de estimulación optogenética Hcrt de nuestro laboratorio18,56.

Para la colocalización de la expresión de ChR2/GCaMP y la inmunorreactividad de la hipocretina, perfundimos transcardialmente ratones con tampón de fosfato seguido de paraformaldehído al 4 % tamponado (pH 7,4). Luego, los cerebros extraídos se posfijaron en paraformaldehído al 4 % durante 2 h antes de colocarlos en una solución de sacarosa al 30 % para la crioprotección durante 48 h. A continuación, los cerebros se seccionaron en un criostato Leica a 30 um y se almacenaron en tampón de fosfato hasta la tinción. Los cortes se bloquearon en solución de albúmina de suero bovino al 5 %/tritón al 0,5 % durante 1 hora a 36 °C. A continuación, los cortes se incubaron en anticuerpo primario contra la hipocretina-A (Abcam ab6214) a una dilución de 1:250 en BSA al 3 %/tritón al 0,3 %. solución durante la noche a 4 C. A continuación, los cortes se lavaron en PBS seguido de una incubación con AlexaFlour594 a una dilución de 1:1000 en una solución de BSA al 3 %/TritonX100 al 0,3 % a 36 C durante 1,5-2 h. Luego, los cortes se lavaron en PBS y luego se montaron con DAPI.

Todos los análisis estadísticos se completaron con GraphPad Prism 8.4.1. Los datos de fotometría de fibra se analizaron mediante análisis de varianza de medidas repetidas (RM-ANOVA) utilizando el tipo de transición y el tiempo (antes frente a después de la transición) como factores estadísticos. Debido a los tamaños de muestra desiguales en las respuestas de prueba, los datos de fotometría de fibra de la transición Precue-to-Cue se analizaron mediante un modelo de efectos mixtos. El efecto de las frecuencias de estimulación optogenética Hcrt sobre el comportamiento se evaluó mediante RM-ANOVA con la frecuencia de estimulación y el genotipo como factores estadísticos. Asimismo, se analizó el efecto del tratamiento farmacológico sobre la conducta mediante RM-ANOVA con genotipo y tratamiento como factores. Las pruebas de comparaciones múltiples de Bonferroni se realizaron post hoc para investigar las diferencias de grupo específicas (Datos complementarios 1). Fuente de datos para las Figs. 2–4 se pueden encontrar en Datos complementarios 2.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los conjuntos de datos generados y analizados durante el estudio actual están disponibles en el repositorio digital de Stanford [https://purl.stanford.edu/sf095mv6553. https://doi.org/10.25740/sf095mv6553].

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Este trabajo fue financiado por subvenciones de Boehringer Ingelheim y NIH (R01HL150566, R01MH116470, R01MH102638) a LdLKJJ que recibió una beca posdoctoral de NRSA (F32HD095597). SMT fue apoyado por una beca postdoctoral Philip Wrightson.

susan m.tyree

Dirección actual: Atlantia Clinical Trials, Cork, Irlanda

Kimberly J. Jennings

Dirección actual: Universidad de Texas, Austin, TX, EE. UU.

Departamento de Psiquiatría y Ciencias del Comportamiento, Facultad de Medicina de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

Susan M. Tyree, Kimberly J. Jennings, Oscar C. Gonzalez, Shi-bin Li & Luis de Lecea

Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, Biberach, Alemania

Janet R. Nicholson y Moritz von Heimendahl

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JRN, MvH y LdL concibieron este trabajo. SMT realizó todos los experimentos de comportamiento, registros de calcio y optogenética y analizó los datos. KJJ realizó registros y análisis de calcio. OCG y S.-BL verificaron la ubicación anatómica de la cánula y realizaron inmunohistoquímica. JRN, MvH y LdL supervisaron el trabajo. LdL escribió el manuscrito con aportes de todos los autores.

Correspondence to Luis de Lecea.

JRN y MvH declaran los siguientes intereses contrapuestos: Son empleados a tiempo completo de Boehringer Ingelheim. Todos los demás autores declaran no tener intereses en competencia.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Karli Montague-Cardoso y George Inglis.

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Reimpresiones y permisos

Tyree, SM, Jennings, KJ, González, OC et al. Las intervenciones optogenéticas y farmacológicas vinculan las neuronas de hipocretina con la impulsividad en ratones. Comun Biol 6, 74 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04409-w

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Recibido: 26 febrero 2021

Aceptado: 03 enero 2023

Publicado: 19 enero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04409-w

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