La consolidación noradrenérgica de la memoria de reconocimiento social está mediada por β

May 27, 2023

Communications Biology volumen 5, Número de artículo: 1097 (2022) Citar este artículo

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La memoria de reconocimiento social (SRM) es fundamental para mantener las relaciones sociales y aumentar la tasa de supervivencia. La corteza prefrontal medial (mPFC) es un área cerebral importante asociada con el almacenamiento de SRM. La liberación de norepinefrina (NE) regula la excitabilidad intrínseca neuronal de mPFC y la transmisión sináptica excitadora, sin embargo, se desconocen los roles de la señalización de NE en el circuito de la vía del locus coeruleus (LC) a mPFC durante el almacenamiento de SRM. Aquí encontramos que las proyecciones de LC-mPFC NE regulaban bidireccionalmente la consolidación de SRM. La infusión de propranolol y los receptores β-adrenérgicos (β-AR) o la inactivación de β-arrestin2 en la mPFC interrumpieron la consolidación de SRM. Cuando se inyectó carvedilol, un β-bloqueador que puede activar levemente la señalización sesgada por β-arrestina, los ratones no mostraron una supresión significativa de la consolidación de SRM. La consolidación deteriorada de SRM causada por la inactivación de β1-AR o β-arrestina2 en la mPFC no se rescató activando las proyecciones de LC-mPFC NE; sin embargo, el SRM deteriorado por la inhibición de las proyecciones de LC-mPFC NE o la desactivación de β1-AR en el mPFC se restauró al activar la vía de señalización de la β-arrestina en el mPFC. Además, la activación de la señalización de β-arrestina mejoró la consolidación de SRM en ratones de edad avanzada. Nuestro estudio sugiere que las proyecciones de LC-mPFC NE regulan la consolidación de SRM a través de la señalización de β-AR sesgada por β-arrestina.

La memoria de reconocimiento social (SRM) es fundamental para establecer y mantener relaciones sociales1, que son esenciales para la adaptación, reproducción y supervivencia ambiental2,3. En roedores, SRM se evalúa por la capacidad de distinguir y preferir congéneres nuevos sobre congéneres familiares que se han encontrado previamente. Al igual que con otras formas de aprendizaje, la información social se adquiere y consolida cuando los rastros lábiles se estabilizan en la memoria a largo plazo4. Los mecanismos subyacentes a la consolidación de SRM no están claros.

La corteza prefrontal medial (mPFC) es fundamental para una amplia gama de comportamientos sociales1,5. La mPFC está incluida en varios neurocircuitos que son cruciales para la memoria social, incluidos los circuitos del hipocampo ventral-mPFC, la amígdala-mPFC y el olfato-mPFC6,7,8. Las infusiones de antagonistas de los receptores NMDA o AMPA/kainato en la mPFC evitan la consolidación de SRM9. Esta evidencia sugiere que la transmisión sináptica glutamatérgica en el mPFC regula la capacidad social y la memoria de reconocimiento social. La excitabilidad neuronal en el mPFC también es fundamental para la memoria social. Las neuronas excitatorias en el mPFC forman conjuntos distintos que están sintonizados con la exploración social y transmiten información sobre objetivos sociales10. La activación de neuronas excitatorias en la mPFC disminuye la exploración social11. La activación quimiogenética de las neuronas excitatorias mPFC en ratones deficientes en Shank3 restaura el reconocimiento social reducido12. La síntesis de proteínas en el mPFC es necesaria para la consolidación de SRM, pero no para el reconocimiento social13. La norepinefrina (NE) es un neuromodulador común que desempeña un papel clave en la atención, la percepción y la cognición14. Las neuronas de noradrenalina en el locus coeruleus (LC), la principal fuente de NE en el sistema nervioso central, se proyectan ampliamente al prosencéfalo, incluido el mPFC a través de una arborización axonal altamente ramificada15,16. Los registros de pinzamiento han demostrado que la liberación de NE mejora la excitabilidad intrínseca neuronal mPFC17, que es bloqueada por el antagonista del receptor β-adrenérgico (β-AR)18. La activación de β-AR también facilita las respuestas postsinápticas de las sinapsis excitatorias en las neuronas piramidales en el mPFC19. Sin embargo, aún se desconoce si el sistema LC-mPFC NE está involucrado en SRM y cómo la señalización NE en el mPFC podría contribuir a la consolidación de SRM.

Los RA-β son receptores acoplados a proteína de unión a nucleótidos de guanina (proteína G) heterotriméricos prototípicos (GPCR) que responden a NE. La unión del ligando induce cambios conformacionales de GPCR que reclutan proteínas G heterotriméricas, lo que conduce a la activación de la adenilato ciclasa. Además, la fosforilación de GPCR dependiente del ligando promueve el reclutamiento de β-arrestina, lo que induce la desensibilización del receptor20. Además, la β-arrestina puede actuar como una proteína de andamiaje, iniciando vías de señalización independientes de las proteínas G21. Nuestros estudios previos mostraron que la señalización sesgada por β-AR/β-arrestina en la corteza entorrinal media la reconsolidación de la memoria de reconocimiento de objetos22. Sin embargo, las contribuciones de la proteína G y la señalización del RA-β sesgada por β-arrestina en la memoria social siguen siendo en gran parte desconocidas.

Dadas las consideraciones anteriores, el presente estudio se centró en las funciones de las proyecciones noradrenérgicas de LC-mPFC y los β-AR y sus vías de señalización aguas abajo en la consolidación de SRM.

Para determinar el efecto de las proyecciones de LC-mPFC NE en el almacenamiento de la memoria social, aplicamos una tarea de memoria de reconocimiento social de tres cámaras bien validada23. Expresamos eNpHR3.0-EYFP o ChR2-mCherry en neuronas LC NE en ratones TH-Cre y detectamos terminales NE en el mPFC (EYFP+ o mCherry+, Fig. 1a, b, g, h). La inhibición optogenética de la terminal 24 eNpHR3.0+ NE en la mPFC disminuyó significativamente la liberación de NE, mientras que la activación optogenética de la terminal 24 ChrimsonR+ NE en la mPFC aumentó significativamente la liberación de NE (Fig. 1a-d complementaria). En la sesión de habituación, que incluye la exposición inicial al aparato de tres cámaras, todos los ratones mostraron una preferencia similar por las dos cámaras exteriores. Durante la fase de entrenamiento (prueba de sociabilidad), los ratones pasaron mucho más tiempo interactuando con un ratón nuevo (N) sobre la jaula de alambre vacía (E) (Fig. 1e, f complementaria), lo que sugiere una sociabilidad similar entre los dos grupos. Estimulamos selectivamente las proyecciones de LC-mPFC NE inmediatamente después de la prueba de sociabilidad (Fig. 1a, g). La prueba SRM se realizó 1 hora o 1 día después de que los ratones fueran expuestos al nuevo ratón, e implicó comparar el tiempo de interacción con el ahora familiar ratón (F) con la interacción con un segundo nuevo ratón (N). La inhibición optogenética de las proyecciones LC-mPFC NE25 no cambió la preferencia por el nuevo ratón en la prueba 1 de SRM (Fig. 1c, d); sin embargo, disminuyó el índice de discriminación en la prueba SRM 2 (Fig. 1e, f), lo que sugiere que se requieren proyecciones LC-mPFC NE para SRM a largo plazo pero no para SRM a corto plazo. Además, en la tarea SRM de tres cámaras, encontramos que la activación optogenética de las proyecciones LC-mPFC NE después del entrenamiento no aumentó la exploración del nuevo ratón en la prueba SRM realizada 1 día después (Fig. 1i, j). SRM se desvanece rápidamente y persiste solo por días en ratones26. Cuando se realizó la prueba SRM 4 días después del entrenamiento, los ratones de control exploraron los ratones nuevos y familiares casi por igual, mientras que los ratones con activación de las proyecciones LC-mPFC NE mostraron una preferencia considerablemente mayor por el ratón nuevo que por el grupo de control ( Fig. 1k, l), lo que sugiere que la mejora de la liberación de NE en mPFC prolongó el mantenimiento de la memoria social y promovió la consolidación de SRM. La activación de los receptores β-adrenérgicos recluta quinasas reguladas por señales extracelulares (ERK), lo que facilita el mantenimiento de la potenciación a largo plazo y la formación de la memoria a largo plazo27. Así, examinamos los niveles de pERK en el mPFC después de la prueba de sociabilidad con estimulación láser. Descubrimos que la exposición a un ratón nuevo aumentó significativamente los niveles de pERK en el mPFC en comparación con los ratones expuestos a un ratón familiar o la jaula de alambre vacía (Fig. 2 complementaria). Además, la inhibición de las proyecciones de LC-mPFC NE suprimió la activación de ERK en el mPFC después de la prueba de sociabilidad (Fig. 1m, n). La activación de las proyecciones de LC-mPFC NE aumentó la activación de ERK en el mPFC de ratones ingenuos, pero no mejoró aún más la activación de ERK después de la prueba de sociabilidad (Fig. 1m, o). Estos hallazgos indican que las proyecciones de LC-mPFC NE podrían regular la consolidación de SRM a través de la señalización adrenérgica aguas abajo, como la activación de ERK.

a, g Esquema experimental. Se inyectó AAV9-EF1α-DIO-eNpHR3.0-EYFP o AAV9-EF1α-DIO-ChR2-mCherry en la LC de ratones TH-Cre y se implantaron fibras ópticas bilateralmente sobre la mPFC. Las proyecciones de LC-mPFC NE se estimularon ópticamente después del entrenamiento y las pruebas de SRM se realizaron 1 h, 1 día o 4 días después del entrenamiento. Se administró láser (590 nm, 10 mW, constantemente durante 10 min; 473 nm, 5 mW, veinte pulsos de 5 ms a 25 Hz, cada 5 s durante 5 min) después de la prueba de sociabilidad. b, h Imágenes representativas de la expresión de eNpHR3.0-EYFP (b) o ChR2-mCherry (h) en la CL con inmunotinción de TH y punta de fibra óptica en la mPFC. c, e, i, k Mapas de calor de la prueba SRM. d, f, j, l Gráfico estadístico del tiempo de exploración para ratones familiares (F) y nuevos (N) y puntuaciones de discriminación [EYFP: n = 12, eNPHR3.0: n = 12. d Izquierda: ratón F × virus ( 1, 22) = 1,628, p = 0,215, ANOVA RM de dos vías; Derecha: Z = 70.000, p = 0.931, prueba U de Mann-Whitney. f Izquierda: ratón F × virus (1, 22) = 9,398, p = 0,006, ANOVA RM bidireccional; Derecha: t (22) = 3,807, p < 0,001, prueba t de Student de dos colas. mCherry: n = 14, ChR2: n = 12. j Izquierda: ratón F × virus (1, 24) = 1,860, p = 0,185, ANOVA RM bidireccional; Derecha: t (24) = −1,664, p = 0,113, prueba t de Student de dos colas. l Izquierda: ratón F × virus (1, 24) = 11,904, p = 0,002, ANOVA RM bidireccional; Derecha: t (24) = −3,983, p < 0,001, prueba t de Student de dos colas]. m Esquema experimental. Se inyectó AAV9-EF1α-DIO-eNpHR3.0-EYFP o AAV9-EF1α-DIO-ChR2-mCherry en la LC de ratones TH-Cre. Las proyecciones de LC-mPFC NE se estimularon ópticamente después de la prueba de sociabilidad. 15 minutos después de la prueba de sociabilidad, se examinaron los niveles de pERK en el mPFC. n Western blot y gráfico de barras representativos para los niveles de pERK en la mPFC con inhibición de las proyecciones de LC-mPFC NE después de la prueba de sociabilidad [n = 7 para cada grupo. F sesión × virus (1, 24) = 6,863, p = 0,015, ANOVA de dos vías]. o Western blot y gráfico de barras representativos para los niveles de pERK en la mPFC con activación de proyecciones LC-mPFC NE después de la prueba de sociabilidad [n = 5 para cada grupo. F sesión × virus (1, 16) = 2,807, p = 0,113, ANOVA de dos vías]. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 y ###p < 0,001 frente al grupo indicado. Barra de escala: 100 μm.

Eliminamos selectivamente Adrb1 o Adrb2 en las neuronas glutamatérgicas mPFC inyectando AAV9-mCaMKIIα-EGFP-P2A-iCre en el mPFC de ratones Adrb1fl / fl o Adrb2fl / fl (Fig. 2a-f). En la tarea SRM de tres cámaras, los ratones con la mitad o la eliminación completa de β1-AR en el mPFC mostraron una menor preferencia por el nuevo ratón en la prueba SRM (Fig. 2g-i), mientras que los ratones con eliminación completa, pero no la mitad de la eliminación de β2-AR en el mPFC mostró una preferencia alterada por el nuevo ratón en la prueba SRM (Fig. 2j). Todos los ratones prefirieron el nuevo ratón a la jaula vacía durante la prueba de sociabilidad (Fig. 3a, b complementaria), lo que sugiere que la eliminación de β1-AR y β2-AR en el mPFC no perjudicó la sociabilidad. La eliminación selectiva de β1-AR en el mPFC no afectó la actividad locomotora (Fig. 3c complementaria); sin embargo, aumentó los niveles de ansiedad, como lo demuestra la disminución de la distancia en el área central y la disminución del tiempo pasado en el área central durante la tarea de campo abierto y el lado claro durante la tarea de caja L/D (Fig. 3d complementaria). h). La eliminación selectiva de β2-AR en el mPFC no tuvo un impacto significativo en los niveles de locomoción o ansiedad (Fig. 3i-n complementaria). Estos resultados mostraron que los ratones con inactivación de β1-AR o β2-AR en el mPFC no pudieron demostrar memoria social, lo que indica que se requiere la expresión de mPFC β-AR para la consolidación de SRM.

a, d Se inyectó AAV9-mCaMKIIα-EGFP-P2A-iCre en el mPFC de ratones Adrb1fl/fl o Adrb2fl/fl y sus compañeros de camada WT. b, e, c, f Imágenes representativas y gráficos estadísticos de los niveles de ARNm adrb1 y adrb2 en el mPFC por FISH. [c WT: n = 4 (3729 celdas), Adrb1fl/fl: n = 4 (3503 celdas), t (6) = 31,54, p < 0,001, prueba t de Student de dos colas; f WT: n = 4 (3192 celdas), Adrb2fl/fl: n = 4 (3538 celdas), t (6) = 3,543, p = 0,012, prueba t de Student de dos colas]. Barra de escala: 50 μm. g Esquema experimental. Se inyectó AAV9-mCaMKIIα-EGFP-P2A-iCre en el mPFC de ratones Adrb1fl/fl o Adrb2fl/fl y sus compañeros de camada WT y heterocigotos. Cuatro semanas después, se realizó la tarea SRM. h Imagen representativa de la expresión de Cre-EGFP en el mPFC. Barra de escala: 500 μm. i, j Gráficos estadísticos del tiempo de exploración para los ratones familiares (F) y nuevos (N) y puntuaciones de discriminación de los ratones con desactivación de Adrb1 o Adrb2 en el mPFC. [i WT: n = 13, Adrb1fl/+: n = 10, Adrb1fl/fl: n = 11. Ratón F × genotipo (2, 31) = 4,085, p = 0,027, ANOVA RM bidireccional; Derecha: F (2, 31) = 5,364, p = 0,01, ANOVA de una vía. j WT: n = 15, Adrb2fl/+: n = 12, Adrb2fl/fl: n = 11. Izquierda: ratón F × genotipo (2, 35) = 4,433, p = 0,019, ANOVA RM bidireccional, derecha: F (2, 35) = 4,139, p = 0,024, ANOVA de una vía]. *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001 frente al grupo indicado.

De acuerdo con los resultados anteriores, probamos los efectos del antagonista no selectivo del RA-β propranolol y carvedilol en la consolidación de SRM. Cuando se infundió propranolol bilateralmente en el mPFC inmediatamente después de la prueba de sociabilidad, el SRM a largo plazo se vio significativamente afectado (Fig. 3a-c), mientras que el SRM a corto plazo permaneció intacto (Fig. 4a-c complementaria). Además, la infusión de propranolol en el mPFC después del entrenamiento no afectó la consolidación de la memoria del condicionamiento del miedo (Figura 5 complementaria). A diferencia de los efectos del propranolol, el carvedilol, un antagonista del RA-β sesgado por la proteína G28,29,30, no afectó la consolidación de SRM (Fig. 3d), lo que sugiere que la consolidación de SRM podría no depender de la vía de la proteína G. En las tareas de SRM, todos los ratones mostraron una preferencia significativa por el nuevo ratón sobre la jaula vacía durante la prueba de sociabilidad (Fig. 4b, d complementaria). Estos datos sugieren que la activación de β-AR en el mPFC está involucrada selectivamente en la consolidación de SRM, y que la señalización no dependiente de la proteína G puede ser necesaria para este proceso de memoria.

un esquema experimental. El antagonista del RA-β, propranolol (10 μg) o carvedilol (5 μg) se infundió inmediatamente después del entrenamiento y las pruebas de SRM se realizaron 1 día después. b Imagen representativa de la implantación de la cánula en la mPFC. Barra de escala: 500 μm. c, d Gráficos estadísticos del tiempo de exploración para ratones familiares (F) y nuevos (N) y puntuaciones de discriminación [c, Vehículo: n = 15, Propranolol: n = 13. Izquierda: ratón F × tratamiento (1, 26) = 6,906, p = 0,014, ANOVA RM de dos vías; Derecha: t (26) = 3,507, p = 0,002, prueba t de Student de dos colas. d Vehículo: n = 12, carvedilol: n = 14. Izquierda: ratón F × tratamiento (1, 24) = 2,707, p = 0,113, ANOVA RM bidireccional; Derecha: t (24) = −1,477, p = 0,153, prueba t de Student de dos colas]. e Imagen representativa de la expresión de Cre-EGFP en el mPFC. Se inyectó AAV9-mCaMKIIα-EGFP-P2A-iCre en el mPFC de ratones Arrb2fl/fl y sus compañeros de camada WT. Barra de escala: 100 μm. f Gráfico de barras para el nivel de expresión relativa del ARNm de Arrb2. 4 semanas después de la inyección de AAV9-mCaMKIIα-EGFP-P2A-iCre en mPFC de ratones Arrb2fl/fl y sus compañeros de camada WT [n = 7 para cada grupo, t (12) = 4,515, p < 0,001, prueba t no apareada de dos colas] . g Transferencias de Western representativas y gráfico de barras para los niveles de pERK en el mPFC con eliminación de β-arrestina2 [n = 5 para cada grupo. F ratón × sesión (1, 16) = 11,556, p = 0,004, ANOVA de dos vías]. h Gráficos estadísticos del tiempo de exploración para ratones familiares (F) y nuevos (N) y puntuaciones de discriminación. [WT: n = 12, Arrb2fl/fl: n = 15. Izquierda: ratón F × genotipo (1, 25) = 7,094, p = 0,013, ANOVA RM bidireccional; Derecha: t (25) = 2,557, p = 0,017, prueba t no pareada de dos colas]. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 y ##p < 0,01 frente al grupo indicado.

Proponemos que la vía de señalización de la β-arrestina en el mPFC podría estar involucrada en la consolidación de SRM. Para probar esta hipótesis, inyectamos AAV9-mCaMKIIα-EGFP-P2A-iCre en el mPFC de ratones Arrb2fl / fl y eliminamos selectivamente β-arrestin2 en las neuronas excitatorias mPFC (Fig. 3e, f). La eliminación selectiva de β-arrestina2 en el mPFC disminuyó significativamente la preferencia por el ratón nuevo sobre el ratón familiar sin influir en la sociabilidad, los niveles de ansiedad o la actividad locomotora (Fig. 3h y Fig. 6a-g complementaria), lo que sugiere que la expresión de β-arrestina2 en el mPFC es necesario para la consolidación de SRM. Las β-arrestinas, que se encuentran aguas abajo de los GPCR, actúan como transductores de señales y median en la activación de una diversa gama de señales y respuestas celulares, incluida la activación de ERK30,31,32. Por lo tanto, examinamos la activación de ERK en el mPFC de ratones knockout de tipo salvaje (WT) y β-arrestin2 después de la prueba de sociabilidad. Los resultados mostraron que la prueba de sociabilidad aumentó significativamente los niveles de pERK en el mPFC de los compañeros de camada WT, pero no en los ratones knockout para β-arrestin2 mPFC (Fig. 3g). Estos resultados indican que la vía de señalización mediada por β-arrestina juega un papel crucial en la consolidación de SRM.

Para confirmar que la consolidación NEérgica de SRM está mediada por β-AR y la vía de señalización sesgada por β-arrestina en el mPFC, realizamos la tarea SRM con ratones knockout para β-AR y β-arrestin2 mPFC con estimulación óptica de terminales LC NE en el mPFC (Fig. 4a, b). La desactivación selectiva de β1-AR en la consolidación de SRM deteriorada de mPFC, que no fue rescatada por la activación optogenética de las proyecciones de LC-mPFC NE (Fig. 4c). Además, la consolidación deteriorada de SRM debido a la eliminación selectiva de β-arrestina2 en el mPFC no se restauró mediante la activación de las proyecciones LC-mPFC NE (Fig. 4e). Además, los ratones WT con proyecciones de LC-mPFC NE activadas mostraron preferencias persistentemente más altas por el nuevo ratón que los ratones del grupo de control, mientras que los ratones con deleción de β1-AR o β-arrestin2 en el mPFC mostraron una discriminación alterada de la Nuevo ratón 4 días después del entrenamiento, incluso con la activación de las proyecciones LC-mPFC NE (Fig. 4d, f).

un esquema experimental. Se inyectaron AAV9-EF1α-DIO-ChR2-mCherry y AAV9-THP-iCre en el LC, AAV9-mCaMKIIα-EGFP-P2A-iCre se inyectó en el mPFC y se implantaron fibras ópticas por encima del mPFC de Adrb1fl/fl o Arrb2fl /fl ratones. Cuatro semanas después, se realizó la tarea SRM. Para la estimulación de los terminales NE en el mPFC, se entregó luz azul (473 nm, veinte pulsos de 5 ms a 25 Hz, cada 5 s, 5 min de duración) después de la prueba de sociabilidad y las pruebas SRM se realizaron 1 día después. b Imágenes representativas de la expresión de ChR2-mCherry en LC, expresión de Cre-EGFP, terminales de ChR2-mCherry+ y punta de fibra óptica en mPFC. c–f Gráficos estadísticos del tiempo de exploración para ratones familiares (F) y nuevos (N) y puntuaciones de discriminación [c, d mCherry/EGFP, n = 12; ChR2/EGFP, n = 11; ChR2/Cre, n = 13; mCherry/Cre, n = 12. c Izquierda: ratón F × virus (3, 44) = 7,961, p < 0,001, ANOVA RM bidireccional; Derecha: F (3, 44) = 4,139, p < 0,001, ANOVA de una vía; d Izquierda: ratón F × virus (3, 44) = 5,895, p = 0,004, ANOVA RM bidireccional; Derecha: F (3, 44) = 8,928, p < 0,001, ANOVA de una vía. e, f mCherry/EGFP, n = 12; ChR2/EGFP, n = 13; ChR2/Cre, n = 13; mCherry/Cre, n = 12. e Izquierda: ratón F × virus (3, 46) = 7,304, p < 0,001, ANOVA RM bidireccional; Derecha: F (3, 46) = 7,469, p < 0,001, ANOVA de una vía; f Izquierda: ratón F × virus (3, 46) = 10,826, p < 0,001, ANOVA RM bidireccional; Derecha: F (3, 46) = 9,586, p < 0,001, ANOVA de una vía]. g scAAV1-hSyn-FlpO se inyectó en el LC y AAV9-EF1α-fDIO-Cre-mCherry se inyectó en el mPFC de ratones Arrb2fl/fl. Imágenes representativas de la expresión de Cre-mCherry en el mPFC. h Gráficos estadísticos del tiempo de exploración para ratones familiares (F) y nuevos (N) y puntuaciones de discriminación [WT: n = 11; Arrb2fl/fl: n = 15. Izquierda: ratón F × virus (1, 24) = 4,7, p = 0,04, ANOVA RM de dos vías, Derecha: t (24) = 2,196, p = 0,038, t de Student de dos colas prueba]. *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001 frente al grupo indicado. Barra de escala: 100 μm.

Los estudios muestran que los títulos altos de AAV1 exhiben una diseminación transináptica anterógrada33. Las inyecciones del AAV1 que expresa la recombinasa Cre/FlpO en el área del cerebro que contiene las neuronas presinápticas y, simultáneamente, el AAV con un casete de expresión inducible por Cre/FlpO en el área aguas abajo, permiten el etiquetado selectivo de las neuronas postsinápticas inervadas por la región presináptica34,35. Luego, inyectamos scAAV1-hSyn-FlpO anterógrado con un título alto en el LC y AAV9-EF1α-fDIO-Cre-mCherry en el mPFC de ratones Arrb2fl/fl, lo que permitió la expresión de la recombinasa Cre y luego la desactivación de β-arrestin2 en mPFC neuronas inervadas por las neuronas adrenérgicas y no adrenérgicas del LC (Fig. 4g). Los ratones con deleción selectiva de β-arrestin2 mostraron una menor preferencia por el nuevo ratón, lo que sugiere que se requiere la expresión de β-arrestin2 en el circuito LC-mPFC para la consolidación de SRM (Fig. 4h). Todos los ratones mostraron una sociabilidad intacta (Fig. 7 complementaria). Los resultados anteriores indican que la regulación de la liberación de LC-mPFC NE durante la consolidación de SRM está mediada por la señalización β-adrenérgica sesgada por β-arrestina.

Desarrollamos un vector de virus adenoasociado y entregamos el mutante R165L rM3Dq (rM3Darr)36 al mPFC para activar farmacológicamente la señalización dependiente de β-arrestina con tratamiento con CNO. Primero confirmamos la activación de la señalización dependiente de β-arrestina en células N2a transfectadas con rM3Darr. Los resultados mostraron que CNO (1 μM) aumentó significativamente los niveles de pERK 15 a 30 minutos después del tratamiento (Fig. 5a). Además, la eliminación de β-arrestina2 inhibió la activación de ERK inducida por el tratamiento con CNO (1 μM) en células N2a con expresión de rM3Darr (Fig. 5b), lo que sugiere que la activación de rM3Darr induce la activación de ERK dependiente de β-arrestina. Luego, expresamos rM3Darr-mCherry en el mPFC y realizamos un experimento SRM de tres cámaras (Fig. 5c, d). Los ratones tratados con CNO (1 mg/kg, ip) inmediatamente después de la prueba de sociabilidad no mostraron una mayor preferencia por el nuevo ratón durante la prueba SRM realizada 1 día después; sin embargo, mostraron una preferencia persistente por el nuevo ratón durante la prueba de SRM realizada 4 días después (Fig. 5e, f), lo que sugiere que la activación de la señalización de β-arrestin2 promueve la consolidación de SRM. A continuación, expresamos rM3Darr-mCherry en mPFC y eNpHR3.0-EYFP en neuronas LC NE e implantamos fibras ópticas en mPFC (Fig. 5g). La inhibición optogenética de las proyecciones de LC-mPFC NE disminuyó la preferencia por el nuevo ratón, mientras que la activación de la señalización de β-arrestina mejoró significativamente la preferencia por el nuevo ratón (Fig. 5h), lo que sugiere que la activación de la vía de señalización de β-arrestina restauró el deterioro social. memoria causada por la inhibición de las proyecciones LC-mPFC NE. Además, expresamos simultáneamente rM3Darr-mCherry y eliminamos β1-AR en el mPFC (Fig. 5i). Aunque la consolidación de SRM se vio afectada por la eliminación de β1-AR en el mPFC, la activación de la vía de señalización de β-arrestina restauró la memoria para el ratón familiar y aumentó la preferencia por el ratón nuevo (Fig. 5j). Todos los ratones prefirieron el nuevo ratón a la jaula vacía durante la prueba de sociabilidad (Fig. 8 complementaria). Estos resultados sugieren que la consolidación de SRM puede promoverse mediante la activación farmacológica de la señalización sesgada por β-arrestina.

a CNO (1 μM) aumentó significativamente los niveles de pERK 15–30 min después del tratamiento en células N2a transfectadas con rM3Darr [n = 7 para cada grupo, 15 min: F (5, 36) = 5,261, p < 0,001, unidireccional ANOVA]. b La eliminación de Arrb2 inhibió la activación de ERK mediante el tratamiento con CNO (1 μM) en células N2a transfectadas con rM3Darr a los 15 min [n = 6 para cada grupo, F shRNA × tratamiento (1, 20) = 8,207, p = 0,010, ANOVA de dos vías ]. c Esquema experimental. Se inyectaron AAV9-hSyn-DIO-rM3Darr-mCherry y AAV9-CAG-Cre en el mPFC de ratones C57BL/6 J. Cuatro semanas después, se realizó la tarea SRM. A los ratones se les inyectó CNO (1 mg/kg, ip) después del entrenamiento y se realizaron pruebas de SRM 1 día y 4 días después. d Imagen representativa de la expresión rM3Darr-mCherry en el mPFC. e, f Gráficos estadísticos del tiempo de exploración para ratones familiares (F) y nuevos (N) y puntuaciones de discriminación [Solución salina, n = 13; CNO, n = 15. e Izquierda: ratón F × tratamiento (1, 26) = 2,29, p = 0,142, ANOVA RM bidireccional; Derecha: t (26) = −1,121, p = 0,273, prueba t de Student de dos colas. f Izquierda: ratón F × tratamiento (1, 26) = 7,024, p = 0,014, ANOVA RM bidireccional; Derecha: t (26) = −2,579, p = 0,016, prueba t de Student de dos colas]. g Inyección de virus e imágenes representativas de la expresión de eNpHR3.0-EYFP en la LC, expresión de rM3Darr-mCherry y punta de fibra óptica en la mPFC. AAV9-EF1α-DIO-eNpHR3.0-EYFP se inyectó en el LC, AAV9-hSyn-DIO-rM3Darr-mCherry y AAV9-CAG-Cre se inyectaron en el mPFC de ratones TH-Cre. Las fibras ópticas se implantaron por encima de la mPFC. h Gráficos estadísticos del tiempo de exploración para ratones familiares (F) y nuevos (N) y puntuaciones de discriminación [EYFP/mCherry, n = 13; EYFP/rM3Darr, n = 12; eNpHR3.0/rM3Darr, n = 14; eNpHR3.0/mCherry, n = 13. Izquierda: ratón F × virus (3, 48) = 7,135, p < 0,001, ANOVA RM bidireccional, derecha: F (3, 48) = 8,697, p < 0,001, uno -vía ANOVA]. i Inyección de virus e imagen representativa de la expresión de rM3Darr-mCherry y Cre-EGFP en la mPFC. j Gráficos estadísticos de tiempo de exploración y puntajes de discriminación [Solución salina, n = 12; CNO, n = 15. Izquierda: F mous × tratamiento (1, 25) = 9,238, p = 0,005, ANOVA RM bidireccional; Derecha: t (25) = −3,638, p = 0,001, prueba t de Student de dos colas]. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 y ###p < 0,001 frente al grupo indicado. Barra de escala: 100 μm.

Una disminución en el aprendizaje declarativo y el rendimiento de la memoria es una ocurrencia común asociada con el envejecimiento37. Nuestros resultados muestran que la consolidación de SRM se ve afectada en ratones de edad avanzada (> 18 meses de edad, Fig. 6a, b). Por lo tanto, expresamos rM3Darr-mCherry en el mPFC de ratones envejecidos (Fig. 6c). Los datos mostraron que el tratamiento con CNO (1 mg/kg, ip) después de la prueba de sociabilidad aumentó significativamente la preferencia por el nuevo ratón en la prueba SRM (Fig. 6d). Todos los ratones prefirieron el nuevo ratón a la jaula vacía durante la prueba de sociabilidad (Fig. 9 complementaria). Estos datos sugieren que la señalización sesgada por β-AR/β-arrestina podría ser un posible objetivo farmacológico para mejorar la memoria social en personas mayores.

un esquema experimental. La tarea SRM se llevó a cabo en ratones envejecidos (>18 meses). b Gráficos estadísticos de tiempo de exploración y puntajes de discriminación [Adulto joven, n = 12; Envejecido, n = 11. Izquierda: ratón F × edad (1, 21) = 9,816, p = 0,005, ANOVA RM bidireccional; Derecha: Z = 33,000, p = 0,045, prueba U de Mann-Whitney]. c Imagen representativa de la expresión rM3Darr-mCherry en el mPFC. Se inyectaron AAV9-hSyn-DIO-rM3Darr-mCherry y AAV9-CAG-Cre en el mPFC de ratones envejecidos (>18 meses de edad). d Gráficos estadísticos del tiempo de exploración para ratones familiares (F) y nuevos (N) y puntuaciones de discriminación [Solución salina, n = 11; CNO, n = 12. Izquierda: ratón F × tratamiento (1, 21) = 4,979, p = 0,037, ANOVA RM de dos vías, Derecha: t (21) = −2,95, p = 0,008, prueba t de Student de dos colas ]. e Modelo de trabajo que ilustra que las proyecciones de LC-mPFC NE regulan la consolidación de la memoria del reconocimiento social a través de la señalización sesgada de β-arrestin2. *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001 frente al grupo indicado. Barra de escala: 100 μm.

En este estudio, encontramos que las proyecciones de LC-mPFC NE controlaban la consolidación de SRM a través de la señalización sesgada de β-AR / β-arrestina en el mPFC (Fig. 6e). La activación de las proyecciones LC-mPFC NE o la señalización de β-arrestina promovieron el mantenimiento de la memoria social. Además, el deterioro de la consolidación de SRM causado por la inhibición de la proyección de NE o la eliminación de β1-AR en el mPFC se restauró mediante la activación de la señalización sesgada por β-arrestina.

La tarea de tres cámaras es un paradigma de prueba ampliamente utilizado para medir cuantitativamente la sociabilidad y la memoria social38,39. El ratón elige entrar en una de las tres cámaras; por lo tanto, la sociabilidad se puede medir comparando directamente la preferencia por un ratón nuevo con la preferencia por una jaula con alambre vacía. Con esta tarea, la memoria de reconocimiento social también se puede evaluar comparando las interacciones con un ratón nuevo con las interacciones con ratones familiares en cada cámara. Sin embargo, no está claro si los ratones prefieren la novedad social o simplemente la novedad en la jaula con cables. Es posible que a los ratones solo les importe que la jaula previamente vacía ahora contenga algo o un ratón nuevo.

Nuestros datos mostraron que la inyección de propranolol, un antagonista β-adrenérgico, o la eliminación del RA-β en el mPFC perjudicó significativamente la consolidación de SRM, mientras que la inyección de carvedilol, un antagonista sesgado de la proteína G β-AR no selectivo y antagonista del RA-α1, indujo no hay tal deterioro. Los distintos efectos de propranolol y carvedilol sugieren que el RA-β, pero no el RA-α1, en el mPFC participa en el proceso de consolidación de SRM. Muchos estudios han demostrado que el RA-α2 en la mPFC está involucrado con la memoria de trabajo, llegando a diferentes conclusiones. Algunos estudios han informado que la activación de α2-AR afecta las funciones de mPFC, como el rendimiento de la memoria de trabajo37,40. Sin embargo, otros estudios han informado que los agonistas adrenérgicos α2 mejoran las funciones de la corteza prefrontal, incluida la memoria de trabajo41,42. Además, se ha demostrado que la administración de un antagonista α2-adrenérgico (que aumenta las concentraciones de NE) mejora el reconocimiento social43. Debido a las expresiones diferenciales de los receptores adrenérgicos α y β en las neuronas e interneuronas piramidales, los diferentes roles de α-AR y β-AR en el mPFC en la consolidación de la memoria de reconocimiento social deben estudiarse más a fondo.

Tras la unión del ligando, los receptores acoplados a proteínas G (GPCR), incluidos los RA-β, experimentan cambios conformacionales que promueven su unión a proteínas G heterotriméricas y arrestinas β. Estudios recientes han indicado que las proteínas G heterotriméricas y las β-arrestinas son capaces de interactuar de forma independiente y reclutar moléculas de señalización intracelular44,45. La mayoría de los ligandos que se unen a los GPCR tienen una actividad de señalización equilibrada o imparcial a través de proteínas G y β-arrestinas. También se han descubierto algunos ligandos con preferencia por una ruta sobre las otras rutas. El carvedilol es un antagonista del RA-β sesgado por la proteína G que activa levemente la señalización de la arrestina β. El propranolol es un antagonista completo que bloquea las vías de la proteína G y la β-arrestina. Estudios previos han demostrado que carvedilol promueve selectivamente el reclutamiento de Gαi a β1-AR, activando la vía sesgada de β-arrestina228,46 e induciendo la transactivación mediada por β1-AR del EGFR y la activación de ERK dependiente de β-arrestina230, lo que sugiere que β -arrestin2 puede mediar la señalización de β1-AR de forma independiente. Durante mucho tiempo se ha postulado que la vía de señalización convencional de proteína G/cAMP/PKA media el papel de los RA-β en la memoria. Estudios previos han demostrado que el bloqueo de la transmisión del RA-β con propranolol afecta la consolidación o reconsolidación de la memoria durante el condicionamiento del miedo, el reconocimiento de objetos y la CPP inducida por cocaína42,47,48. La inhibición de las actividades de ciertos componentes de las vías acopladas a proteína G, como PKA y CREB, interrumpe la consolidación y reconsolidación de la memoria49,50. Sin embargo, la reconsolidación de la memoria requiere la síntesis de proteínas pero no la activación de la PKA51. Nuestros estudios anteriores han sugerido que la señalización sesgada de β-arrestina en la corteza entorrinal media la reconsolidación de la memoria de reconocimiento de objetos22, lo que sugiere que la vía de señalización dependiente de β-arrestina debería desempeñar un papel en el almacenamiento de la memoria. En este estudio, carvedilol no suprimió SRM en la prueba de retención de memoria 1 mientras que propranolol sí lo hizo, lo que sugiere que la consolidación de SRM después del entrenamiento podría no depender de una vía sesgada por la proteína G. Además, los ratones con inactivación de β-arrestina 2 en el mPFC mostraron una consolidación deteriorada de SRM. Cuando la vía de señalización de β-arrestina se activó después del entrenamiento, se promovió el mantenimiento de SRM y se rescató la consolidación de SRM deteriorada causada por la inhibición de las proyecciones de LC-mPFC o la eliminación de β1-AR. Por lo tanto, proponemos que la regulación de las proyecciones de LC-mPFC NE podría regular la consolidación de SRM a través de vías de señalización sesgadas por β-arrestina en el mPFC.

Estudios previos han indicado que los animales envejecidos muestran niveles de interacción significativamente reducidos con nuevos ratones juveniles durante las tareas sociales, incluso con la ausencia de deterioro cognitivo manifiesto52,53, lo que sugiere que los circuitos sociales son particularmente vulnerables durante el envejecimiento. Durante mucho tiempo se ha informado que las neuronas LC se reducen significativamente en personas mayores54 y animales que en individuos jóvenes55, lo que podría contribuir a problemas de memoria social en ratones de edad avanzada. En este estudio, encontramos que la activación directa de la señalización de β-arrestina al estimular las neuronas que expresan rM3Darr en el mPFC aumentó significativamente la exploración preferencial en ratones de edad avanzada. Por lo tanto, nuestro estudio demuestra que la señalización sesgada por β-arrestina es fundamental para el almacenamiento de SRM.

El concepto de sesgo de ligando en la señalización descendente de GPCR ha ganado recientemente una atención creciente. Varios ligandos sesgados tienen potencial clínico, incluidos los ligandos sesgados de β-arrestina del receptor de angiotensina II tipo 1 (AT1R)56, los ligandos sesgados de proteína G del receptor µ-opioide (MOR)57 y los ligandos sesgados de β-arrestina del receptor de dopamina D258. Sin embargo, el número de ligandos sesgados que se han informado en la literatura aún es limitado. Nuestros resultados sugieren que la señalización sesgada por β-AR/β-arrestina es crítica para el almacenamiento de SRM, lo que demuestra el potencial para desarrollar nuevos agonistas de β-AR con activación específica sesgada por β-arrestina para mejorar la memoria.

Nuestro estudio sugiere que las proyecciones de LC-mPFC NE regulan la consolidación de la memoria de reconocimiento social a través de las vías de señalización sesgadas por β-AR/β-arrestina, proporcionando evidencia de las funciones neurobiológicas de la vía sesgada por β-arrestina en el almacenamiento de la memoria. Estos datos indican que los ligandos β-adrenérgicos sesgados por β-arrestina pueden ser un objetivo potencial de fármacos para mejorar el almacenamiento de memoria y tratar enfermedades psicológicas.

Nuestro laboratorio desarrolló ratones macho transgénicos Adrb1fl/fl y Adrb2fl/fl y se retrocruzaron más de 10 veces con la cepa C57BL/6J (Adrb1: ENSMUSE000000000294435; Adrb2: ENSMUSE00000399288). Arrb2fl/fl fueron proporcionados amablemente por el profesor Pei Gang (Institutos de Ciencias Biológicas de Shanghai, Academia de Ciencias de China). Se adquirieron ratones TH-Cre de Jackson Laboratory (número de catálogo: 008601). Se compraron ratones C57BL/6J macho de cinco semanas de edad en el Centro de animales de laboratorio de Shanghái, CAS. Todos los ratones se alojaron en grupo con 3-4 por jaula bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12 h (20:00-8:00 luz encendida) con acceso a agua y comida ad libitum. Se utilizaron ratones adultos (8–10 semanas de edad) y ratones envejecidos (>18 meses). Todas las pruebas de comportamiento se realizaron durante su período de apagado. Todos los tratamientos con animales cumplieron estrictamente con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de Shanghai de la Universidad de Fudan. Los descendientes se genotiparon utilizando los siguientes conjuntos de cebadores: 5'-CTGTTCGCATCGGAATGAAGC-3'; 5'-TGACGTCATGAACTGGGATTTCAG-3' (ratones Adrb1fl/fl); 5′-TTGCCGCAGTCTGAAGAAGC-3′; 5'-AGGAAGGATTGTCTCCCAGTATGAC-3' (ratones Arrb2fl/fl); 5'-GGTTGCACAGCAGCCCTAGAT-3'; 5'-CCGTTATGTGCACCAGACTTTAGG-3' (ratones Adrb2fl/fl); 5'-GAGACAGAACTCGGGACCAC-3'; 5'-AGGCAAATTTTGGTGTACGG-3' (ratones TH-Cre). Todos los sujetos de comportamiento se habituaron individualmente al experimentador al menos durante 3 días.

Propranolol [(+/-)-propranolol HCl] (Sigma-Aldrich, #P0884-1G) se disolvió en solución salina. Se disolvió carvedilol (Tocris Bioscience, #2685) en solución salina que contenía dimetilsulfóxido al 1%. Propranolol (10 μg) o carvedilol (5 μg) se infundieron bilateralmente en el mPFC. Se disolvió N-óxido de clozapina [CNO] (Sigma-Aldrich, #C0832-5MG) en solución salina. A los ratones se les inyectó por vía intraperitoneal CNO (1 mg/kg, ip).

El vector pcDNA3.1 que lleva rM3Darr fue proporcionado por el profesor Ken-ichiro Nakajima, quien generó esta construcción que contiene M3 con la mutación puntual R165L. AAV9-hSyn-DIO-rM3Darr-mCherry se desarrolló para activar selectivamente la señalización sesgada por β-arrestina sin perturbar las vías mediadas por proteína G en respuesta al tratamiento con CNO como se describió anteriormente36. La secuencia Cre de pCAG-Cre-GFP (Addgene Plasmid # 13776) se clonó en pAAV2-THP-EGFP (Addgene Plasmid # 80336) a través de los sitios de las enzimas de restricción ECOR I y Sal I. Se empaquetaron AAV9-mCaMKIIα-EGFP-P2A-iCre, AAV9-mCaMKIIα-EGFP, AAV9-EF1α-Flex-ChrimsonR-tdTomato, AAV9-THP-Cre, scAAV1-hSyn-FlpO y AAV9-EF1α-fDIO-Cre-mCherry de Taitool Biological Co., Ltd. NE2h-EGFP y AAV9-CAG-Cre fueron empaquetados por Neuron Biotech Co., Ltd. AAV9-EF1α-DIO-hChR2(H134R)-mCherry y AAV9-EF1α-DIO-mCherry fueron empaquetados por BrainVTA Co., Ltd. Los títulos de AAV oscilaron entre 2,0 × 1012 y 2,5 × 1012 del genoma del vector (vg) ml−1 en todos los experimentos. Se aplicó un título alto de scAAV1-hSyn-FlpO (1 × 1013 genoma del vector (vg) ml−1) para la infección anterógrada.

Los ratones se anestesiaron con isoflurano (3,5 % de inducción, 1,5–2 % de mantenimiento) y se colocaron en un aparato estereotáxico (Stoelting Instruments, EE. UU.). El virus se infundió en el mPFC (desde bregma: anterior-posterior (AP), + 1,8 mm; mediolateral (ML), ± 0,30 mm; y dorsal-ventral (DV), -2,5 mm), o el LC (AP, −5,4 mm; ML, ± 0,85 mm; y DV, −4,0 mm). El virus se administró utilizando una jeringa de 10 μl y una aguja roma de calibre 36 bajo el control de una bomba ultra micro UMP3 (World Precision Instruments, EE. UU.) con un volumen y caudal controlados (150 nl a 50 nl/min). Después de la inyección, se dejó la aguja durante 10 minutos adicionales y luego se retiró lentamente. Las fibras ópticas (0,37 NA, 200 μm de diámetro del núcleo; Anilab) se implantaron por encima de la mPFC (AP, +1,9 mm; ML, ±1,1 mm; y DV, −2,4 mm, ángulo de 20°). Después de la cirugía, se permitió que los ratones se recuperaran durante al menos tres semanas antes de los experimentos de comportamiento.

Los ratones se anestesiaron con isoflurano (3,5% de inducción, 1,5-2% de mantenimiento) y se colocaron en un aparato estereotáxico. Las cánulas guía del pedestal del fármaco (calibre 27, RWD Life Science Co. Ltd.) se implantaron bilateralmente 1 mm por encima de la mPFC (AP, +1,9 mm; ML, ±1,1 mm; y DV, −1,4 mm, ángulo de 20°). Se permitió que los animales se recuperaran de la cirugía durante al menos 2 semanas antes de las pruebas de comportamiento. Se conectó una aguja de acero de calibre 34 con una proyección de 1,0 mm a una bomba de infusión (BAS Bioanalytical Systems Inc.). Se infundió propranolol (10 μg), carvedilol (5 μg) o solución salina a través de la cánula guía bilateralmente después de la prueba de sociabilidad de 3 cámaras o el condicionamiento del miedo.

Los animales se perfundieron transcardiacamente con paraformaldehído (PFA) al 4% en tampón de fosfato de sodio (PB) 0,1 M y luego se fijaron posteriormente durante 4 h. Los cerebros se crioprotegieron con sacarosa al 30 % (peso/vol)/solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante al menos 48 h y los cortes se seccionaron a 30 μm con un vibratomo (CM3050S, Leica). Los cortes se bloquearon con suero de cabra normal al 10 % en PBS con Triton X-100 al 0,3 % (PBST), luego se incubaron con anticuerpos primarios contra TH59 (ratón; 1:1000; Millipore AB152), RFP60 (conejo, 1:500; Rockland, 600-401-379) o GFP61 (pollo, 1:500; Thermo Fisher Scientific, A-10262), en PBST a 4 °C durante la noche. Las secciones se enjuagaron tres veces con PBS durante 15 minutos cada una a temperatura ambiente (TA), seguido de la incubación del anticuerpo secundario [Alexa-488 o Cy3 IgG (ratón, conejo o pollo, 1:50 000, Jackson ImmunoResearch)] en PBST a TA durante 2 h. Luego, las secciones se enjuagaron tres veces con PBS durante 15 minutos cada una y luego se montaron en portaobjetos. Las imágenes se vieron y fotografiaron con Nikon A1 confocal utilizando objetivos de ×10 o ×20.

La tarea de comportamiento social se realizó en un aparato de tres cámaras, una caja rectangular de plexiglás no transparente (40 cm de largo × 63 cm de ancho × 23 cm de alto). La caja estaba dividida por dos paredes de plexiglás con una pequeña puerta circular (7 cm de diámetro). Dos cámaras exteriores (40 cm de largo × 21 cm de ancho × 23 cm de alto) estaban conectadas por una cámara central (40 cm de largo × 21 cm de ancho × 23 cm de alto). El test SRM se realizó después de la sesión de Habituación y el test de Sociabilidad10.

Se soltó al ratón sujeto en el compartimento central y se le permitió explorar la caja de tres cámaras con un contenedor de alambre vacío en cada cámara exterior durante 10 min durante 3 días consecutivos.

El cuarto día, se introdujo un ratón macho juvenil (ratón nuevo, de 3 a 5 semanas de edad), que no había tenido contacto previo con el ratón en cuestión, en una jaula con alambre en una cámara designada como el compartimento "social". Mientras tanto, una jaula de alambre idéntica que permaneció vacía se colocó en la otra cámara. Se soltó al ratón sujeto en la cámara central y se le permitió explorar las tres cámaras durante dos ensayos de 10 min, con un intervalo de 15 min entre ensayos. Se contó la cantidad de tiempo que los ratones exploraron dentro de un radio de 2 cm proximal a cada jaula de alambre (aproximación, parada, montaje de olfateo y tiempo de contacto nariz con nariz).

Las pruebas de SRM se llevaron a cabo 1 h, 1 día o 4 días después de las pruebas de sociabilidad, y el ratón sujeto se soltó en la cámara intermedia durante 10 min. Durante la prueba de retención de memoria, una cámara contenía una jaula de alambre con un ratón macho extraño juvenil (ratón nuevo, de 3 a 5 semanas de edad) y la otra cámara contenía una jaula de alambre con el ratón familiar expuesto previamente en la prueba de sociabilidad (ratón familiar). Por lo tanto, el ratón familiar es el mismo que se usa en la prueba de sociabilidad y el ratón nuevo es diferente en cada prueba SRM. Una vez más, la ubicación del ratón nuevo y el ratón familiar se equilibró entre sesiones. La jaula de alambre se limpió a fondo antes y entre ensayos. Todas las sesiones fueron grabadas con una cámara de video digital. La cantidad de tiempo que los ratones exploraron los ratones familiares y nuevos durante cada sesión se analizó con el software Ethovision XT (Noldus, Wageningen, Países Bajos).

El puntaje de discriminación de sociabilidad (Ec. 1) se calculó como:

La puntuación de discriminación de la memoria social (Ec. 2) se calculó como:

La estimulación optogenética se administró inmediatamente después de la prueba de sociabilidad (3 a 4 semanas después de la infusión de virus y la implantación de fibra óptica). Las fibras ópticas se conectaron a un láser de 473 nm (luz azul) o 590 nm (luz amarilla) (Shanghai Dream Lasers Technology Co. Ltd.) a través de un latiguillo con un par de conectores FC/PC y una fibra óptica 1 × 2 Junta rotativa. Para la estimulación de ChR2, se entregó luz azul a 5 mW con veinte pulsos de 5 ms a 25 Hz, cada 5 s durante 5 min. Para la estimulación de eNpHR3.0, se entregó luz amarilla constantemente a 10 mW durante 10 min. La salida de luz láser a través de las fibras ópticas se ajustó mediante una consola medidora de potencia digital y se moduló con un estimulador de pulsos Master 8 (AMPI).

Los virus AAV9-EF1α-Flex-ChrimsonR-tdTomato o AAV9-EF1α-DIO-eNpHR3.0-EYFP y AAV9-hSyn-NE2h-EGFP se inyectaron individualmente en la LC y la mPFC. Una fibra óptica (200 μm de diámetro, 0,48 de apertura numérica (NA), tecnología Hangzhou Newdoon) se implantó unilateralmente en el mPFC. Los registros de fotometría se realizaron después de la infusión de virus y la implantación de fibra óptica de 3 a 4 semanas. Para la fotoestimulación optogenética, las fibras ópticas se conectaron con láser de 590 nm (luz amarilla) (Thinker Tech Nanjing Biotech) a través de un latiguillo. Para la estimulación de terminales ChrimsonR+ NE en el mPFC, se administró estimulación óptica (590 nm, 5 mW, pulsos de 5 ms a 5, 25 y 50 Hz, 1 s de duración) cada 15 s durante 15 a 20 ensayos a través de una fibra óptica implantado en la mPFC. Para la estimulación de los terminales eNpHR3.0 en la mPFC, se administró estimulación óptica (590 nm, 10 mW, 10 s de duración) cada 15 s durante 15 a 20 ensayos a través de una fibra óptica implantada en la mPFC. Al mismo tiempo, se registró la dinámica de fluorescencia del sensor NE, NE2h62, a través de la misma fibra óptica implantada en el mPFC. La fotometría de fibra se realizó de manera similar a antes. Brevemente, el sensor NE se excitó utilizando dos fuentes de excitación correspondientes a una luz LED de 470 nm de longitud de onda y 405 nm de longitud de onda. La luz pasó a través de filtros de excitación a un cable de conexión de fibra óptica que estaba conectado a la fibra implantada crónicamente. La intensidad de la luz en la punta del cable de conexión fue de alrededor de 0,25 mW. La luz de emisión del sensor NE viajó de regreso a través de las mismas fibras hacia un fotorreceptor. Las señales de voltaje analógico se digitalizaron a 100 Hz y se registraron utilizando el software Fiber photometry (Thinker Tech Nanjing Biotech). Los datos se segmentaron en función de los eventos de estimulación óptica dentro de los ensayos individuales. Las puntuaciones Z de los 2 s antes de la estimulación se tomaron como referencia. Los datos de fotometría se analizaron con códigos MATLAB personalizados (MATLAB R2019a, MathWorks).

Para la tarea de acondicionamiento del miedo, los ratones se introdujeron en la cámara de acondicionamiento (Med Associates) durante 3 min. Un día después, los ratones se volvieron a colocar en la cámara y recibieron tres pares de descargas de tono (Tono: 2800 Hz, 85 dB, 30 s; FS: 0,5 mA, 1 s) con un intervalo entre pruebas de 2 min. Veinticuatro horas más tarde, se realizó una prueba de memoria de miedo contextual y los ratones se expusieron a la cámara de acondicionamiento durante 3 min sin tono. Se realizó otra cohorte de ratones con una prueba de memoria de miedo con claves con 3 ensayos de tono (2800 Hz, 85 dB, 30 s) con intervalos de 30 segundos en un contexto novedoso. El porcentaje de tiempo dedicado a la congelación fue analizado automáticamente por un programa informático (Med Associates).

La prueba OF es uno de los métodos más utilizados para evaluar la actividad locomotora y los niveles de ansiedad innata de los roedores. Dos días antes de las pruebas, se permitió que los ratones se habituaran al entorno en el que se realizó la prueba OF. La actividad locomotora se midió en una arena de campo abierto (40 × 40 cm) durante 30 min bajo una luminancia de 25 Lux. El aparato se limpió antes y entre ensayos. La distancia total, la distancia y la duración en el área central se analizaron utilizando un sistema de detección automatizado (TopScan, CleverSys. lnc.).

La caja L/D (46 × 27 × 30 cm) estaba hecha de plexiglás y constaba de dos compartimentos. La sección más grande era el compartimento brillante (dos tercios de la caja) y la sección más pequeña era el compartimento oscuro (un tercio de la caja). La prueba se realizó con una luminancia de 25 lux en la caja de luz. Los ratones se soltaron del centro de la caja de luz de espaldas a la entrada y se les permitió explorar el aparato durante 6 min. La caja L/D se limpió antes y entre pruebas. El tiempo pasado en el compartimento oscuro se analizó utilizando un sistema de detección automatizado (TopScan, CleverSys. lnc.).

El laberinto O elevado constaba de dos brazos abiertos y dos brazos cerrados con paredes laterales. La altura del laberinto O era de 100 cm desde el suelo. Los ratones se colocaron en el centro del brazo abierto y se les permitió explorar durante 6 min. El laberinto O se limpió antes y entre cada sendero. El tiempo empleado en cada brazo se analizó con el software Clever System (TopScan, CleverSys. lnc.).

Los ratones se perfundieron intracardiacamente con solución salina primero, luego con paraformaldehído al 4% en tampón Na2HPO4/NaH2PO4 0,1 M (pH = 7,5), y se extrajeron los cerebros. Después de la fijación posterior en paraformaldehído al 4 % durante 4 h, las muestras se almacenaron en sacarosa al 30 %/PBS durante 3 días. FISH se realizó en cortes de cerebro congelados fijos de 10 μm de espesor, siguiendo los procedimientos de RNAscope (Advanced Cell Diagnostics, Inc., Newark, CA, EE. UU.). En resumen, se cortaron coronalmente secciones congeladas (10 µm de espesor) a través de la formación de mPFC. Las secciones se montaron descongeladas en portaobjetos de microscopio Superfrost Plus (Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.) y se pretrataron para la digestión con proteasa durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego, las secciones se incubaron con sondas de ratón Adrb1 y Adrb2 (Adrb1, número de acceso: NM_007419.2, región objetivo 158–1830; Adrb2, número de acceso: NM_007420.3, región objetivo 55–962) durante 2 h a 40 °C con mezcla de sonda etiquetada por portaobjetos. La sonda con hibridación no específica se eliminó lavando las secciones en tampón de lavado 1X a temperatura ambiente, seguido del Amplificador 1-FL durante 30 min, el Amplificador 2-FL durante 30 min y el Amplificador 3-FL durante 15 min a 40 °C. Cada amplificador se eliminó lavando con tampón de lavado 1X durante 2 min a temperatura ambiente. Los portaobjetos se visualizaron, analizaron y fotografiaron con un microscopio LSM 510 (Zeiss).

Se inyectó el virus AAV9-mCaMKIIα-EGFP-P2A-iCre en el mPFC de ratones Arrb2fl/fl y sus compañeros de camada WT. Cuatro semanas más tarde, la mPFC se diseccionó en hielo inmediatamente con Maxtrix para ratón (Plastic one Inc). El ARN total se extrajo de mPFC de ratones Arrb2fl/fl y WT utilizando el reactivo TRIzol® (Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, MA, EE. UU.). La transcripción inversa con cebadores aleatorios se realizó de acuerdo con el sistema Hiscript QRT SuperMix (Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd) en un programa de ciclo que consta de 2 min a 42 °C, 15 min a 50 °C, 2 min a 85 °C . La PCR cuantitativa se realizó por triplicado con ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd) mediante un termociclador de PCR en tiempo real (Eppendorf realplex2 Mastercycler ep realplex, Alemania). Los cebadores para el ARNm de CKO Arrb2 se diseñaron flanqueando el exón 2 (5'-GGGAGGGGAAGGAGGAAA-3' y 5'-TGCAGTTAGGGCTCGACTTC-3'). Los cebadores para el ARNm de WT Arrb2 se diseñaron dentro del exón 2 (5'-GGGAGGGGAAGGAGGAAA-3' y 5'-TGCAGTTAGGGCTCGACTTC-3'). Los cebadores para GAPDH son 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' y 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'.

Las células de neuroblastoma de ratón (N2a) fueron proporcionadas amablemente por el profesor Pei Gang (Institutos de Ciencias Biológicas de Shanghai, Academia de Ciencias de China). Las células N2a se colocaron en placas a razón de 20.000 células por pocillo en placas de 12 pocillos. Después de 20 h, las células se transfectaron transitoriamente con AAV-hSyn-DIO-rM3Darr-mCherry/CAG-cre y β-arrestin2-shRNA con el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific). Aproximadamente 48 h más tarde, las células se incubaron durante la noche en medio sin suero antes de la estimulación con CNO (1 μM). Luego, las células se recogieron con tampón de lisis Ripa (Beyotime, #P0013B) en hielo.

Los ratones del experimento se alojaron en grupo con ratones juveniles durante 3 días. Durante las pruebas de sociabilidad, los ratones fueron expuestos a las tres cámaras que contenían una jaula de alambre con un ratón familiar o nuevo. Para el control de las pruebas de sociabilidad, los ratones se mantuvieron en jaulas con o sin estimulación óptica. Los ratones se sacrificaron 15 min después de la prueba de sociabilidad con o sin estimulación óptica. Se realizó una tarea estándar de SRM de tres cámaras en otra cohorte de ratones que se sacrificó 15 minutos después de la prueba de sociabilidad seguida de estimulación con láser. Los cerebros se extrajeron inmediatamente y las muestras de tejido del mPFC o las muestras de proteína celular se homogeneizaron con tampón de lisis que contenía fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1,0 μM (Beyotime, n.° P0013B), se incubaron en hielo durante 30 min y se centrifugaron a 12 000 × g durante 15 min a 4 °C. La concentración de proteína se determinó por ensayo BCA (Thermo Fisher Scientific, #23227). Cada muestra se ajustó a una concentración de proteína final de 2 μg/μl, se mezcló con tampón de carga 6x SDS (Beyotime, #P0015F) y se hirvió durante 10 min a 95 °C. Las muestras se cargaron en electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 10% (SDS-PAGE). Las proteínas se transfirieron electroforéticamente desde geles a membranas de nitrocelulosa (NC) (Whatman) que luego se incubaron con los siguientes anticuerpos primarios: anti-pERK63 (dilución 1:1000, #9101 S, Cell Signaling Technology), anti-ERK63 (1:2000 , #4696 S, Tecnología de señalización celular) a 4 °C durante la noche. Las membranas se enjuagaron en solución salina tamponada con Tris con Tween-20 al 0,1% (TBST) durante 15 min durante tres veces y luego se incubaron con inmunoglobulina G (IgG) anti-conejo o anti-ratón conjugada con IRDye 700DX o 800DX (1:50,000; Rockland Immunochemicals Inc.) durante 1,5 h a temperatura ambiente. Las bandas de proteína se visualizaron utilizando Odyssey (LI-COR Biosciences). Las inmunotransferencias se analizaron con el software Image J. El nivel de fosforilación de ERK se calculó normalizando la intensidad de pERK a la expresión total de ERK.

Los datos experimentales se presentaron como la media ± sem y se trazaron con GraphPad Prism. Los datos de las pruebas de comportamiento se analizaron mediante la prueba t de Student de dos colas, análisis de varianza unidireccional (ANOVA) o ANOVA de dos vías con medidas repetidas seguidas de la prueba post hoc de Bonferroni con sesiones como un factor dentro de los sujetos y AAV como un factor entre sujetos. El registro de fotometría se analizó con la prueba t de Student de dos colas o ANOVA unidireccional para el transitorio de fluorescencia. Los datos de inmunofluorescencia se analizaron mediante la prueba t de Student de dos colas. Los datos de transferencia Western se analizaron mediante ANOVA de dos vías. Los datos no normalizados se analizaron con la prueba U de Mann-Whitney y ANOVA unidireccional de Kruskal-Wallis en rangos. Los análisis estadísticos completos correspondientes a cada conjunto de datos se presentan en Datos complementarios 1. Todos los experimentos se replicaron de forma independiente en 4 a 15 ratones, como se indica en la figura. Cuando fue posible, los datos se recopilaron utilizando réplicas biológicas (cortes de múltiples cerebros por animal analizados para experimentos de hibridación in situ). Nuestros tamaños de muestra se estimaron en base a la experiencia previa y son similares a los empleados generalmente en el campo.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Todos los datos necesarios para evaluar las conclusiones del artículo están presentes en el artículo y/o el material complementario. La Fig. 10 complementaria contiene versiones sin recortar de todas las manchas en el papel. Los Datos Suplementarios 2 contienen valores de datos fuente que subyacen a las Figs. 1d, f, j, l, n, o, 2c, f, i–j, 3c–d, f–h, 4c–f, h, 5a, b, e–f, h, j y 6b, d .

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Agradecemos al Dr. Gang Pei (Institutos de Ciencias Biológicas de Shanghai, Academia de Ciencias de China) por los ratones Arrb2fl/fl y al Dr. Ken-ichiro Nakajima por la construcción M3 mutante R165L. Esta investigación fue apoyada por el Proyecto de Innovación 2030 de Ciencia y Tecnología de China (2021ZD0203500 a FW y LM, 2021ZD0202104 a XL), Subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32171041 a XL, 31930046 a LM, 82021002 a LM), el Fondo de Innovación CAMS para Ciencias Médicas (2021-I2M-5-009 a LM y XL), el Proyecto Principal de Ciencia y Tecnología Municipal de Shanghai (2018SHZDZX01 a LM), ZJ Lab y Shanghai Center for Brain Science and Brain-Inspired Technology, and Chinese Postdoctoral Science Foundation (2021M690684 a CC).

Facultad de Ciencias Médicas Básicas, Laboratorio Estatal Clave de Neurobiología Médica, Centro de Fronteras del Ministerio de Educación para la Ciencia del Cerebro, Institutos de Ciencias del Cerebro, Departamento de Neurología, Centro de Investigación Farmacológica, Hospital Huashan, Universidad de Fudan, 200032, Shanghái, China

Deqin Cheng, Junwen Wu, Enhui Yan, Xiaocen Fan, Feifei Wang, Lan Ma y Xing Liu

Unidad de Investigación de la Memoria de la Adicción, Academia China de Ciencias Médicas (2021RU009), 200032, Shanghái, China

Deqin Cheng, Junwen Wu, Enhui Yan, Xiaocen Fan, Feifei Wang, Lan Ma y Xing Liu

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DC, XL y LM planificaron los experimentos. DC y JW realizaron las pruebas de comportamiento. DC y EY llevaron a cabo los experimentos de bioquímica y cirugía estereotáxica. DC contribuyó al cultivo celular y los experimentos de transferencia de Western. XF realizó el ensayo FISH. DC, EY, JW y FW analizaron los datos. DC y XL redactaron el manuscrito. XL y LM revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Lan Ma o Xing Liu.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Felix Leroy, Steven (A) Thomas y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores de manejo principal: Christian Wozny y George Inglis. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Cheng, D., Wu, J., Yan, E. et al. La consolidación noradrenérgica de la memoria de reconocimiento social está mediada por señalización sesgada por β-arrestina en la corteza prefrontal del ratón. Commun Biol 5, 1097 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04051-y

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Recibido: 14 de marzo de 2022

Aceptado: 28 de septiembre de 2022

Publicado: 17 de octubre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04051-y

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