Una proyección excitatoria directa desde las neuronas de la capa entorrinal 6b al hipocampo contribuye a la codificación espacial y la memoria.

Jun 14, 2023

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 4826 (2022) Citar este artículo

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La formación del hipocampo (HF) de los mamíferos juega un papel clave en varias funciones cerebrales superiores, como la codificación espacial, el aprendizaje y la memoria. Su arquitectura de circuito simple a menudo se ve como un bucle trisináptico, que procesa la entrada que se origina en las capas superficiales de la corteza entorrinal (EC) y la envía de regreso a sus capas más profundas. Aquí, mostramos que las neuronas excitatorias en la capa 6b del proyecto EC del ratón a todas las subregiones que comprenden el HF y reciben información del CA1, el tálamo y el claustro. Además, su salida se caracteriza por corrientes postsinápticas excitatorias únicas de decaimiento lento capaces de impulsar potenciales tipo meseta en sus objetivos postsinápticos. La inhibición optogenética de la vía EC-6b afecta la codificación espacial en las neuronas piramidales CA1, mientras que la ablación celular perjudica no solo la adquisición de nuevos recuerdos espaciales, sino también la degradación de los adquiridos previamente. Nuestros resultados proporcionan evidencia de un papel funcional para las neuronas de la capa cortical 6b en el cerebro adulto.

El hipocampo es una región cortical en el cerebro de los mamíferos necesaria para los procesos mnemotécnicos y el comportamiento relacionado con el espacio1. Basado en el trabajo morfológico clásico, el circuito de la formación del hipocampo (HF) a menudo se ve como un bucle, que comienza en las dos capas superficiales 2 y 3 de la corteza entorrinal (EC) y termina en sus capas más profundas2,3 después de ser retransmitido. a través de las principales subregiones del hipocampo (giro dentado (DG), CA3 y CA1) de forma unidireccional4,5. A la luz de esta arquitectura de circuito, es sorprendente que diversas manipulaciones en las capas superficiales de EC solo produzcan cambios menores en la actividad y la dinámica de las neuronas principales del hipocampo6,7,8,9,10,11. Por lo tanto, se debe considerar la presencia de vías sinápticas alternativas.

Recientemente desarrollamos una técnica para el etiquetado retrógrado transsináptico basado en la rabia confiable y eficiente12, que mejora las tecnologías existentes13,14. Al usar esta técnica, encontramos que el hipocampo no solo recibe información canónica de las capas 2 y 3 del EC, sino también de sus capas profundas, particularmente la capa 612. Como la capa 6 constituye una parte importante del EC y contiene una gran proporción de neuronas excitatorias, esta región del cerebro puede tener un impacto considerable en la actividad de la red del hipocampo. Hasta la fecha, las neuronas de esta capa han sido categorizadas exclusivamente por su característica morfología dendrítica polimórfica2,3,15,16. Aunque se demostró que esta capa albergaba células con patrones de activación espacialmente selectivos, que recuerdan la actividad de las células de rejilla17, no se ha realizado una caracterización molecular, anatómica, fisiológica o funcional detallada de esta población celular.

Una dificultad importante en el análisis de la función de la capa 6 es su compleja organización. Aunque la capa cortical 6 a menudo se considera una sola capa uniforme, las neuronas de la capa 6b (a veces denominada capa 718) son diferentes de las neuronas de la capa 6a desde el punto de vista del desarrollo, la genética y la morfología19,20. Las neuronas de la capa 6b se diferencian mucho antes que las neuronas de la capa 6a y expresan varios marcadores específicos de las neuronas de la subplaca (SPN), incluidos Complexin 3 (Cplx3), Neurexophilin 4 (Nxph4) y el factor de crecimiento del tejido conectivo (Ctgf)21,22, 23 Aunque generalmente se piensa que los SPN son una población transitoria24,25, se ha demostrado la presencia de una fracción persistente de SPN22,26. En particular, la capa entorrinal 6 es más parecida a la capa cortical 6b27 que a la capa 6a28 y, a menudo, parece continuar con la capa de células delgadas que se piensa que representa el remanente de la subplaca18,24,26. Estos resultados plantean la posibilidad de que más allá de su función en el desarrollo cortical24,29,30,31, las neuronas de la capa 6b puedan regular la función del circuito en el hipocampo adulto. Sin embargo, esta hipótesis no ha sido probada directamente.

Para estudiar la conectividad y la función de red de la entrada de la capa profunda de EC al hipocampo, combinamos el etiquetado transináptico basado en el virus de la rabia, la caracterización molecular, la electrofisiología, la optogenética y el análisis del comportamiento. Encontramos que, en el cerebro adulto, las neuronas EC-6b están conectadas monosinápticamente a las neuronas principales del hipocampo y tienen un efecto sorprendentemente poderoso en la actividad de la red del hipocampo, desde la neurona única hasta el nivel conductual.

Para lograr una mejor caracterización molecular de las neuronas EC-6, primero examinamos la expresión de varios marcadores neuronales (Fig. 1a-c complementaria). Descubrimos que esta capa no expresa marcadores conocidos para la capa neocortical 6a, como Ntsr1, pero era rica en biomarcadores conocidos para SPN, como Cplx3, Nxph4 y Ctgf21,22,23 (Fig. 1a-c complementaria). Utilizando una base de datos de secuenciación de ARN unicelular32 e hibridación fluorescente in situ (FISH), descubrimos que en la corteza posterior adulta, estos genes SPN característicos son poderosos marcadores de selección para una población distinta de neuronas excitatorias, únicas tanto dentro de la capa cortical 6 grupo, y dentro de la placa cortical en general (Fig. 1d-h complementaria). De acuerdo con estas observaciones, el inmunomarcaje para CPLX3 produjo una fuerte señal en los somas de las células en la capa cortical más profunda, denominada capa 6b o subplaca (definida como una banda de 50 μm de ancho por encima de la sustancia blanca22), pero también a lo largo de la capa 1 cortical y del hipocampo. , es decir, estrato molecular (SM), donde solo se pudieron detectar unos pocos somas CPLX3 + (Fig. 1a y Fig. 2a y b complementarias).

una sección horizontal representativa teñida para CPLX3 y DAPI (izquierda) junto con una vista ampliada de la corteza (derecha). b Imágenes STED representativas de LEC-1, teñidas para CPLX3 junto con VGluT1 (arriba a la izquierda) o VGAT (abajo a la izquierda). Las inserciones expandidas se muestran a la derecha de cada imagen sobre su máscara correspondiente, lo que demuestra el cálculo de colocalización para cada marcador. c Análisis de la densidad sináptica, utilizando imágenes STED adquiridas de los campos indicados por cuadrados verdes discontinuos en (a). La densidad sináptica se calculó aquí como la relación entre el área de la señal y el área total de la imagen. d Densidad de señal relativa de eCPLX3 e iCPLX3 del área de señal total de VGluT1 o VGAT. La inyección unilateral de retAAV en el CA1 permite la orientación genética del CA3 contralateral para el etiquetado retrógrado, aprovechando la abundancia de axones comisurales de las neuronas piramidales de CA3 (esquemas superiores). Secciones horizontales representativas del hipocampo dorsal medio de los hemisferios ipsilateral (abajo a la izquierda) y contralateral (abajo al centro) para la inyección de RetAAV-cre. Las neuronas doblemente marcadas en el recuadro ampliado (abajo a la derecha) son células iniciadoras putativas. f, g Sección horizontal representativa del hipocampo ventral después del marcaje retrógrado específico de CA3 revela una población de neuronas en la capa más profunda de la CE (f), que inmunomarca positiva para el marcador específico de subplaca CPLX3 (72/78 células contadas de 5 animales, g). h Secciones horizontales representativas de la capa 6b después del etiquetado retrógrado con CVS-N2c(deltaG)-tdTomato, de neuronas CA3 de un ratón GAD1-EGFP (izquierda). Los números encima de las barras en el panel de la derecha indican el número total de somas tdTomato+/EGFP+ con doble etiqueta del total de somas tdTomato+ por cada una de las regiones examinadas (P = 1,2 × 10−9; prueba exacta de Fisher bilateral) . i Dos pSPN que proyectan CA3 marcados con biocitina (magenta) de una sección aguda del hipocampo (izquierda) y un agrandamiento de un segmento dendrítico (derecha). El experimento se ha reproducido para 12 celdas con resultados idénticos. j Trazas representativas de EPSC espontáneos (traza superior) y potencial de membrana después de inyecciones actuales de −50 pA (azul), 100 pA (rojo) y 200 pA (negro; trazas inferiores). La siguiente gráfica de resumen muestra la frecuencia de disparo en función de la amplitud actual (N = 31 celdas). Las barras de escala para los EPSC representativos ampliados (trazo superior) y el primer AP en la corriente de reobase (trazo inferior) indican 25 ms/20 pA y 2 ms/20 mV, respectivamente. N en c, d representa el número de secciones individuales de 6 animales diferentes. Los datos en c, d, j se muestran como media y SEM.

Dado que CPLX3 es una proteína sináptica33, planteamos la hipótesis de que la inmunorreactividad de CPLX3 a lo largo de la SM podría indicar la existencia de sinapsis que surgen de la población de SPN persistentes. Usando imágenes de agotamiento de emisión estimulada (STED) del SM tomadas de diferentes subregiones del hipocampo y parahipocampo, pudimos confirmar que en estas regiones, CPLX3 se colocalizó extensamente con el transportador vesicular de glutamato 1 (VGluT1) y el transportador vesicular GABA (VGAT ), respectivamente. Estos terminales CPLX3+ excitadores o inhibitorios (eCPLX3/iCPLX3) se detectaron en proporciones similares entre sí, pero en proporciones variables en las diferentes subregiones del HF (Fig. 1b, c y Fig. 2c, d complementaria). Se observó una excepción notable en el CA3 SM, donde las terminales eCPLX3 representaron casi el 15 % de todas las terminales glutamatérgicas, mientras que las terminales iCPLX3 representaron menos del 5 % de todas las GABAérgicas.

Para probar si estos terminales surgen de las neuronas EC-6b, nos dirigimos genéticamente a las neuronas piramidales CA3 para el etiquetado retrógrado transsináptico inyectando primero el CA1 contralateral de la línea reportera Ai9 de tdTomato cre, con virus adenoasociado transportable retrógradamente (retAAV)34 que expresa cre -recombinasa, y el CA3 ipsilateral con virus adenoasociado (AAV) que expresa un casete TVA-2A-N2cG dependiente de cre. Una inyección posterior de vectores virales de la rabia CVS-N2c con pseudotipado envA y eliminación de G (RVdGenvA-CVS-N2c) que expresan EGFP12,14, dos semanas después de la aplicación de ambos AAV, condujo a un marcado retrógrado extenso y específico de las neuronas piramidales CA3 ( Fig. 1d y Fig. complementaria 3a, b). De acuerdo con el conocimiento previo, se pudo observar una señal de EGFP generalizada a lo largo de la capa 2 de la EC medial y lateral (MEC y LEC, respectivamente) y, de acuerdo con nuestra predicción, también en las neuronas CPLX3 + EC-6b (Fig. 1e, f). Dado que en el cerebro en desarrollo, la capa de la subplaca podría dar lugar a neuronas de proyección tanto excitatorias como inhibitorias36, realizamos un experimento de etiquetado retrógrado adicional utilizando ratones GAD1-EGFP y descubrimos que la gran mayoría de las neuronas de proyección de EC-6b eran GAD1 -negativo (Fig. 1h y Fig. Suplementaria 3c, d). Los registros electrofisiológicos intracelulares y las imágenes posteriores de neuronas que proyectan CA3 llenas de biocitina en EC-6b revelaron una arborización polimórfica de dendritas densamente espinosas (Fig. 1i), corrientes postsinápticas excitatorias espontáneas (EPSC) y actividad de pico moderada en respuesta a las inyecciones actuales ( Fig. 1j y Tabla Suplementaria 1). Estas observaciones sugieren que las neuronas en la capa más profunda de la CE son SPN persistentes, continuas con la capa cortical 6b, y confirman la existencia de una proyección excitatoria directa a la SM del hipocampo CA3. Por el contrario, los terminales iCPLX3 que hemos detectado pueden surgir de interneuronas Cplx3 + SM locales, lo que coincide con el perfil molecular de las células neurogliaformes de capa 1 descritas anteriormente37 (Fig. 4a, d complementarias). En conjunto, estos resultados demuestran la presencia de una conexión sináptica excitadora directa desde las neuronas EC-6b al hipocampo.

Para evaluar la extensión anatómica de las neuronas EC-6b que proyectan CA3 y cuantificar su proporción relativa con respecto a otras poblaciones corticales que proyectan CA3, diseccionamos, aclaramos ópticamente y tomamos imágenes de toda la HF, usando microscopía confocal, siguiendo el marcaje retrógrado transsináptico de el CA3 (Fig. 2a, b). El análisis resultante reveló que se encontraron neuronas que proyectan CA3 a lo largo de todo el eje dorsoventral del EC-6b con una densidad sustancialmente mayor cerca de su polo ventral, opuesto al LEC (Fig. 2c).

una descripción esquemática en 3D de los diferentes componentes que componen la formación del hipocampo. A, D, M indican Anterior, Dorsal y Medial, respectivamente. b Preparación corticohipocámpica limpia e intacta después del etiquetado asistido por retAAV de las neuronas CA3, como se muestra en la Fig. 1e (rojo—tdTomato, Cyan—N2c-EGFP; arriba a la izquierda), junto con proyecciones del plano XY a lo largo de las líneas trazadas (izquierda , abajo) y una imagen anotada de la preparación en el plano Z (derecha). c Representación visual de la distribución de neuronas marcadas con N2c-EGFP en EC y HC, siguiendo el etiquetado retrógrado de CA3. d, esquema de etiquetado retrógrado específico de CA1 (arriba a la izquierda) e imágenes confocales representativas de HC (abajo a la izquierda) y EC (derecha). e Igual que c pero para marcaje retrógrado del CA1. f Esquema de etiquetado retrógrado específico de DGC (arriba a la izquierda) e imágenes confocales representativas de HC (abajo a la izquierda) y EC (derecha). g Igual que c pero para marcaje retrógrado del DG. h Esquema de etiquetado retrógrado específico de CA1 IN (arriba a la izquierda) e imágenes confocales representativas de HC (abajo a la izquierda) y EC (derecha). i, Igual que c pero para el marcaje retrógrado de las interneuronas del hipocampo. j Distribución del etiquetado en las subregiones cortico-hipocampales siguiendo el etiquetado retrógrado de CA3, CA1 y DG. La fracción en cada región se calculó por separado para cada condición del número total de neuronas de segundo orden. k Fracción de SPN entorrinales del número total de neuronas de proyección en el EC, siguiendo el marcaje retrógrado de las interneuronas CA3, CA1, DG e hipocampales. l Números de neuronas de segundo y primer orden para cada población iniciadora (izquierda) junto con un gráfico de resumen de las proporciones calculadas de neuronas de segundo y primer orden (derecha). Para todos los cálculos, el número de CA3 y células musgosas se multiplicó por 2 para dar cuenta del número de neuronas de proyección comisural. Para DG, n = 6, para todas las demás condiciones, n = 4 ratones. A menos que se indique lo contrario, las barras de escala representan 200 µm. La imagen en a fue adquirida usando el Brain Explorer 2™ del Instituto Allen. Los datos en jl se muestran como media y SEM con puntos de datos individuales para cada experimento.

Dado que también se observaron terminales eCPLX3 en el SM de todas las demás subregiones del hipocampo, aunque en densidades más bajas, ampliamos este enfoque para incluir el etiquetado retrógrado de las interneuronas CA1, DG e hipocampales. Para identificar socios presinápticos de las neuronas piramidales CA1, estas células se dirigieron mediante la inyección de un cassette AAV cre-off, bajo el control del promotor CaMKIIa12 en la región CA1 de ratones KA1-cre, en los que cre se expresa selectivamente en CA3 y DG38 ( Fig. 2d), evitando así el etiquetado retrógrado de CA3 cercano y la mayoría de las neuronas CA2 (Fig. 5a, b complementarias). Estos experimentos revelaron que, además de la entrada principal EC-3 y EC-5a, que se ha descrito recientemente con más detalle39 (Fig. 5c, d complementaria), las neuronas CA1 también recibieron una entrada sustancial del polo dorsal del EC-6b, opuesto al MEC (Fig. 2d, e, j) que, de manera similar a la proyección EC-6b al CA3, consiste predominantemente en neuronas excitatorias (Fig. 6a complementaria).

Para identificar socios presinápticos de células granulares dentadas (DGC), inyectamos AAV dependientes de cre en la línea Prox1-cre específica de DGC (Fig. 2f). Descubrimos que esta población recibió una entrada excitatoria distribuida uniformemente, pero escasa, del EC-6b (Fig. 2f-j y Fig. 6b complementaria). Finalmente, para determinar si la proyección de EC-6b podría reclutar la inhibición del avance, además de la excitación, realizamos un marcaje retrógrado usando RVdGenvA-CVS-N2c-tdTomato de IN del hipocampo, mediante la expresión mediada por AAV de un dependiente de Flp. casete en el hipocampo de la línea DLX5 / 6-FlpE específica de IN, cruzada con una línea reportera EGFP Flp12 (Fig. 2h y Fig. 6c complementaria). Las células marcadas retrógradamente incluían neuronas principales en el hipocampo y en las capas corticales superficiales, junto con un etiquetado muy escaso de neuronas en EC-6b (Fig. 2h-j y Fig. 6d, e complementarias). Este resultado sugiere que las neuronas EC-6b reclutan menos inhibición de avance que las neuronas EC-2/3, lo que potencialmente aumenta su contribución relativa al impulso excitatorio extrínseco general de las neuronas piramidales del hipocampo.

Para determinar la contribución relativa de las entradas excitatorias de EC-6b en cada una de estas poblaciones de hipocampo, calculamos para cada ratón la fracción de neuronas etiquetadas retrógradamente en la capa 6b de la población etiquetada total en todas las capas de EC (Fig. 2k). Descubrimos que esta relación rastreaba las estimaciones de densidad sináptica relativa de eCPLX3 / VGluT1 descritas en la Fig. 1c. Tanto las proporciones informadas en la Fig. 1c como las de la Fig. 2k proporcionaron estimaciones independientes, pero muy similares, de la contribución de la proyección EC-6b a la entrada cortical neta, lo que brinda apoyo adicional a estos resultados. Esta validación cruzada permite la aproximación de la contribución relativa de esta proyección en regiones que no se pueden diseccionar fácilmente para el etiquetado retrógrado, mediante la cuantificación de la densidad sináptica local de eCPLX3. La cuantificación adicional de la proporción de neuronas de segundo/primer orden para las poblaciones de neuronas excitatorias confirmó el etiquetado de alto rendimiento en todas las condiciones, observándose proporciones más bajas después del etiquetado retrógrado del DG (Fig. 2l), posiblemente debido a un alto grado de divergencia de un pequeño número de neuronas EC a un gran número de DGCs40. Estos resultados demuestran que la proyección EC-6b se dirige a todas las subpoblaciones del hipocampo, con preferencia hacia las neuronas excitatorias en CA1 y CA3.

Nuestros resultados proporcionan una descripción detallada de la proyección del hipocampo EC-6b. Sin embargo, para comprender qué tipo de información transmiten estas células, se requiere una caracterización funcional paralela de sus entradas sinápticas. Encontramos que la línea conductora Ctgf-2A-dgCre41,42 permite la disección genética inducible de las neuronas Cplx3+ EC-6b excitatorias, pero no las IN de la capa 1 de Cplx3+ EC o las SM IN del hipocampo, tras la administración del antibiótico Trimetoprim (TMP) (Fig. 3a). y la figura complementaria 7a-c). Luego, estos ratones se usaron para apuntar al EC-6b para el etiquetado dual anterógrado y retrógrado, mediado por una combinación de vectores AAV dependientes de cre y RVdGenvA-CVS-N2c, para reconstruir su red extendida de conexiones (Fig. 3b y Suplementario Figura 7d, e).

a Secciones horizontales representativas del ratón Ctgf-2A-dgCre cruzadas con la línea reportera Ai9 tdTomato demuestran una disección genética inducible por TMP eficiente de las neuronas Cplx3+ en la capa cortical 6b. b Una ilustración del esquema de inyección de AAV para el marcaje doble anterógrado y retrógrado específico de la subplaca. c, d Una sección horizontal representativa después del marcaje retrógrado de la subplaca entorrinal y el inmunomarcaje para NeuN (c) y secciones coronales representativas (d), que demuestran las proyecciones hacia y desde las regiones corticales y subcorticales. e Una sección horizontal representativa, inmunomarcada para CPLX3 (izquierda) y vistas mejoradas del área de transición CA3-CA1 y las capas profundas de la EC, luego del inmunomarcado para PCP4. ld-lámina disecante. f Gráficos de resumen que muestran el recuento de neuronas de todas las regiones que se proyectan a la subplaca entorrinal, en relación con el número total de neuronas EGFP+ contadas en cada preparación, medidas a partir de tejido cortical y del tronco encefálico intacto y limpio (n = 6 ratones). g, Densidad de etiquetado de núcleos NeuN+ + EGFP+ en regiones clave, en relación con su respectivo recuento total de NeuN (n = 5 ratones). Los datos en f, g se muestran como puntos de datos individuales (círculos abiertos), media (círculos rellenos) y SEM.

El rastreo de axones de las neuronas tdTomato+ reveló que, además de las estructuras dentro del HF, que previamente se encontró que eran inmunoreactivas para CPLX3, esta población también se proyectaba escasamente al núcleo septal lateral (LS) y las regiones lamelares de los núcleos talámicos anteriores (ATN). El trazado retrógrado concomitante con RVdGenvA-CVS-N2c-EGFP reveló proyecciones a las neuronas EC-6b desde el núcleo septal medial (MS) y la banda diagonal de Broca (DBB), así como los núcleos del núcleo talámico que comprenden el ATN (AD-Anterodorsal ; AM—Anteromedial; AV—Anteroventral) junto con el núcleo reuniens (Re) (Fig. 3d). A partir de la placa cortical, se originaron escasas proyecciones de la corteza cingulada (Cg), la corteza retroesplenial (RSC) y la amígdala cortico-basal (CoA). Si bien todas estas regiones se han asociado previamente con la red hipocampal extendida, también encontramos una proyección prominente de toda la extensión anteroposterior del claustrum (Cla), cuya asociación con el HF rara vez se observa (Fig. 3c, d, f, g). Las neuronas EC-6b también recibieron una gran cantidad de información de subpoblaciones específicas dentro del HF; desde el hipocampo propiamente dicho, la entrada excitatoria surge exclusivamente de CA1 y subiculum, junto con una población de neuronas presuntamente inhibitorias en CA3 Stratum oriens y radiatum. Desde dentro de la EC, la capa 5a surgió como la principal fuente de entrada para EC-6b, con una entrada más escasa de las otras capas corticales, como se distingue por el etiquetado de PCP4, que se encontró que se expresaba selectivamente en las neuronas EC-3 y EC-5b. , pero no EC-2 y EC-5a43 (Fig. 3e-g).

Toda la evidencia presentada hasta el momento apunta a la existencia de una conexión sináptica estructural entre las neuronas EC-6b y las neuronas principales del hipocampo. Sin embargo, aún es posible que estos contactos sean solo remanentes estructurales de etapas tempranas de desarrollo y no representen sinapsis funcionales en el cerebro adulto. Para abordar esta posibilidad, expresamos un actuador optogenético en la capa 6b cruzando la línea Ctgf-2A-dgCre con ratones Ai32, que expresan condicionalmente ChR2(H134R)-EYFP, y medimos las respuestas inducidas optogenéticamente de las neuronas piramidales en CA3b (Fig. 4a y la figura complementaria 8a-c). Para comparar las propiedades fisiológicas de la proyección EC-6b al CA3 con otras vías conocidas, también expresamos actuadores específicamente en neuronas EC-2 y DGC. El primero se logró mediante el etiquetado retrógrado de la DG, que conduce a un etiquetado extenso de EC-2, pero solo un etiquetado escaso de EC-6b (Fig. 4b y Fig. 8d-j complementaria), y el último por medio de Inyección de AAV-EF1a-DIO-ChIEF-2A-dTomato en el DG de ratones Prox1-cre (Fig. 4c). Si bien se observaron respuestas postsinápticas después de la estimulación de la vía EC-6b, estas fueron marcadamente diferentes de las de la vía perforante (PP) o las proyecciones de fibra musgosa (MF) al CA3 (Fig. 4d-i). Si bien la amplitud máxima del EPSC y la latencia hasta el inicio de los EPSC EC-6b-CA3 fueron idénticas a las de los EPSC PP-CA3 (Fig. 4j, k), el tiempo de aumento del 20% al 80%, la constante de tiempo de decaimiento y la duración fueron significativamente más lentos , y la depresión a corto plazo fue casi absoluta (Fig. 4l-o). De manera similar, los potenciales postsinápticos excitatorios (EPSP) de EC-6b-CA3 tienen un curso de tiempo lento, que se asemeja a los potenciales de meseta descritos anteriormente en las neuronas del hipocampo44 (Fig. 4p). Registros adicionales de corrientes y potenciales evocados optogenéticamente confirmaron que los EPSC eran sensibles al antagonista de AMPAR y KAR 6-ciano-7-nitroquinoxalina-2,3-diona (CNQX) bajo un potencial de retención negativo (−60 mV) pero que grandes NMDAR todavía se pueden observar corrientes bajo un potencial de mantenimiento positivo (+40 mV). Esto proporciona una confirmación adicional de que estas corrientes están mediadas predominantemente por la liberación de glutamato y que la cinética lenta no es el resultado de la actividad polisináptica, ya que CNQX la bloquearía (Fig. 4q-r y Fig. 9a-f complementaria). En conjunto, estos resultados indican que las neuronas EC-6b establecen una conexión sináptica glutamatérgica única y poderosa con las neuronas piramidales CA3.

a–c Imágenes representativas de cortes hipocampales agudos después de la expresión específica de actuadores optogenéticos (amarillo) específicamente en EC-6b (a), EC-2 (b) o DG (c) mientras se registran las respuestas postsinápticas de las neuronas en CA3b (magenta). El círculo blanco discontinuo indica la región objetivo de la fotoestimulación y las barras de escala representan 200 µm. d-f Rastros individuales representativos (gris) y promediados (negro) de EPSC evocados optogenéticamente, siguiendo un tren de 10 Hz de pulsos de luz de 5 ms de 6b-CA3 (d), PP-CA3 (e) o MF -CA3 (f) Proyecciones. g–i Diez respuestas de voltaje superpuestas a la estimulación con 6b-CA3 (g), PP-CA3 (h) o MF-CA3 (i). j–o Gráficos de resumen que comparan las propiedades de EPSC para cada una de las vías: amplitud máxima de la primera respuesta (j), latencia hasta el inicio de EPSC desde el inicio de la estimulación (k), 20–80 % de tiempo de subida (l), decaimiento constante de tiempo (m), duración a la mitad del máximo (n) y relación de pulsos apareados en un intervalo interestímulo de 100 ms (o). Los puntos de datos individuales se muestran como círculos abiertos y las barras indican la media y el SEM para cada condición. Los esquemas sobre los gráficos ilustran la propiedad EPSC medida que se muestra en cada uno. p–r Respuestas representativas de 6b-CA3 que muestran EPSP en forma de meseta con un solo AP truncado (p; gris, trazas individuales; negro, promedio), EPSC registrados en presencia de 100 μM de gabazina y 25 μM de CNQX a un potencial de retención negativo ( q) y EPSC registrados en presencia de gabazina 100 μM, CNQX 25 μM y D-AP5 50 μM con un potencial de retención positivo (r). Número de mediciones de cada condición que se muestra entre paréntesis en la leyenda (ver k). Los gráficos j-o muestran puntos de datos individuales, con la media y SEM como líneas negras verticales y horizontales. Se consideraron significativas las diferencias estadísticas con P < 0,05 utilizando la prueba bilateral de Mann-Whitney (ajustada por Holm-Bonferroni). Los asteriscos simples (*), dobles (**) y triples (***) indican P < 0,05, P < 0,01 y P < 0,001, respectivamente.

Si bien no se ha predicho la existencia de una proyección excitatoria capaz de producir potenciales postsinápticos de tipo meseta, previamente se demostró que patrones de actividad similares son suficientes para la generación de nuevos campos de lugar en las neuronas piramidales CA144,45, lo que sugiere que la vía EC-6b podría juegan un papel crucial en el procesamiento de la información espacial (SI). Para probar esta hipótesis, expresamos específicamente el inhibidor optogenético ArchT en las neuronas de la capa 6b, cruzando la línea conductora Ctgf-2A-dgCre con ratones informadores Ai40, en los que ArchT-EGFP se expresa condicionalmente (Fig. 5a). Luego, implantamos crónicamente a estos animales con una fibra óptica sobre el CA1 SM, junto con seis tetrodos móviles de forma independiente en la capa piramidal del CA1 (Fig. 10a complementaria). Nos enfocamos en la región CA1, donde esperábamos los mayores efectos de la manipulación experimental, porque los efectos directos a través de las sinapsis EC-6b-CA1 y los efectos de red indirectos (EC-6b–DG–CA3–CA1 y EC-6b–CA3–CA1) podría acumularse. Luego, los animales se colocaron en una arena cuadrada y, después de una sesión de familiarización de 30 minutos de duración (S1), se les dejó continuar la exploración durante 30 minutos adicionales con la fotoinhibición activada solo en un cuadrante asignado al azar (S2). Esto fue seguido por una tercera sesión de 30 minutos, durante la cual nuevamente, no se aplicó fotoinhibición (S3) (Fig. 5b). El análisis posterior de la puntuación SI de las células piramidales putativas reveló que la fotoinhibición condujo a una disminución aguda en el SI solo en el cuadrante manipulado durante la sesión de fotoinhibición, que se restableció en gran medida una vez que se eliminó la fotoinhibición (cuadrante objetivo: P = 1.02 × 10−23; resto de la arena: P = 0,01; prueba de Mann-Whitney bilateral, Fig. 5c). Esta disminución en SI no pudo explicarse por ningún correlato de comportamiento observable, como la ocupación o la velocidad de movimiento, y de manera similar no se asoció con ningún cambio en las propiedades básicas de activación de las neuronas excitatorias o inhibitorias en la capa de células piramidales CA1 (Fig. 10b–j). Como entre todas las neuronas que proyectan el hipocampo, solo la capa 6b de EC expresó Ctgf (Fig. 8a-c complementaria), estos resultados indican que las neuronas EC-6b regulan la codificación espacial.

una sección parasagital representativa que muestra la expresión específica de ArchT-EGFP en la capa 6b y la ubicación de la fibra óptica en un Ctgf-2A-dgCre cruzado con un ratón reportero cre ArchT-EGFP (Ai40). b Gráficas de posición representativas para las tres sesiones de exposición consecutivas (arriba) y mapas de tasa de disparo correspondientes de 12 unidades representativas, clasificadas por su puntaje de información espacial en S3. Los números sobre cada gráfico indican la tasa de disparo máxima (Hz). c Un diagrama de resumen que muestra la información espacial promedio para las celdas piramidales CA1 dentro del cuadrante iluminado (verde) en relación con el resto de la arena (gris) en cada sesión de exposición (izquierda) junto con un diagrama de caja que muestra el cambio mediano en SI entre S2- S1 y S3-S1 para celdas dentro y fuera de la región objetivo (derecha). El centro de la gráfica de caja, los límites de la caja y los bigotes representan la mediana, el percentil 25 superior e inferior y el percentil 10 superior e inferior, respectivamente. Se incluyeron en el análisis un total de 184 unidades de 4 animales. Los asteriscos simples (*) y triples (***) indican P < 0,05 y P < 0,001, respectivamente. d Imágenes representativas del hipocampo de un ratón Ctgf-2A-dgCre cruzado con un ratón Rosa(stop)DTA, inmunomarcado para CPLX3, ya sea sin (arriba a la izquierda) o 9 días después de la administración de TMP (arriba a la derecha) con imágenes STED representativas tomadas de el CA3 SM a continuación demuestra la densidad de VGluT1 y eCPLX3 en cada punto de tiempo. Los cambios en la densidad de VGluT1 y eCPLX3/VGluT1 se cuantifican para CA1 y CA3 SM en diferentes momentos después de la administración de TMP, donde cada punto representa un animal individual (n = 3 animales por grupo) y las líneas representan el promedio para cada condición ( trama inferior). e Diagrama esquemático del protocolo experimental en el intellicage. f Gráfica de tiempo de la tasa de error de grupo promedio durante cada uno de los días experimentales. Se administró TMP el día experimental 0, indicado por una flecha negra. g Diagrama de dispersión entre la densidad de terminales eCPLX3 sobrevivientes en el CA3 SM, calculado a partir de imágenes STED, y la tasa de error para cada animal en el grupo TMP, en los días experimentales 8 y 9, correspondientes al último día de la nueva ubicación final ( D) y el primer día de regreso al lugar familiar (A*), respectivamente. Coeficiente de correlación de rangos de Spearman de una cola (rs) con su valor P correspondiente indicado a continuación y líneas de regresión discontinuas que se muestran para cada grupo. Los datos en (c, izquierda) y f se muestran como media y SEM y las barras de escala en las imágenes representan 200 µm.

Con base en estos hallazgos, planteamos la hipótesis de que esta nueva vía sináptica podría ser igualmente importante para mediar en la formación y retención de la memoria espacial. Para abordar esta pregunta, cruzamos ratones Ctgf-2A-dgCre con ratones RosaStopDTA, para permitir una ablación condicional selectiva de la población EC-6b en el cerebro adulto, mientras se evitan todas las demás proyecciones hipocampales excitatorias de largo alcance (Fig. 5d y suplemento). Fig. 8a–c). Luego, los animales doblemente transgénicos se co-alojaron en un entorno inteligente46, lo que nos permitió controlar de forma remota la ubicación de la disponibilidad de agua para cada animal individualmente y monitorear su comportamiento de exploración. Después de un período de habituación, asignamos a cada animal un puerto específico (Fig. 5e; "A") donde podría tener acceso ilimitado al agua y 5 días después, inyectamos a los animales con TMP, para inducir la ablación específica de la capa 6b, o con solución vehicular. Inmediatamente después de esta manipulación, asignamos a cada animal a un puerto de agua diferente, girado simétricamente a una esquina y lado diferentes durante un período de 3 días. En total, este proceso se repitió tres veces (Fig. 5e; "B", "C" y "D") antes de reasignar a los animales al puerto original, cuya ubicación aprendieron antes de la manipulación (Fig. 5e, " A*"). Descubrimos que la capacidad de los animales ablacionados con EC-6b para aprender nuevas ubicaciones de recompensa se vio afectada ("D" versus "A"), a un ritmo que siguió de cerca al del proceso de ablación (Fig. 5d). Inesperadamente, estos ratones también tuvieron dificultades para olvidar la ubicación que habían aprendido inmediatamente antes de la manipulación ("A*" frente a "A").

El análisis ANOVA de tres vías con transformación de rango alineado reveló efectos significativos de la sesión y el día experimental, y además demostró una interacción altamente significativa entre el grupo (TMP versus vehículo) y la sesión (A, D, A*; P = 1.3 × 10−4), lo que indica que la ablación celular afectó significativa pero diferencialmente el aprendizaje en sesiones nuevas y familiares (Fig. 5e). Tanto en la nueva sesión "D" como en la sesión familiar "A*", los animales con ablación de EC-6b mostraron un aprendizaje reducido ("D": TMP, P = 0,036 versus Veh, P = 1,8 × 10−4; "A*": TMP, P = 0,116 frente a Veh, P = 2,2 × 10−4). Dado que los efectos en animales individuales fueron variables, planteamos la hipótesis de que el rendimiento de los animales se correlacionará con el grado de ablación. Para probar esta hipótesis, graficamos la tasa de error individual en los días 8 y 9 de la prueba de comportamiento, correspondiente al último día del tercer puerto nuevo y el primer día después del regreso al puerto familiar, contra el grado de ablación de la capa 6b, medido por la densidad de los terminales eCPLX3 restantes en relación con la densidad total de VGluT1 en el CA3 (Fig. 5g). Descubrimos que la adquisición de nuevos recuerdos espaciales se correlacionó significativamente con la densidad de eCPLX3, mientras que para la retención de recuerdos previamente adquiridos hubo una tendencia en la dirección opuesta (Fig. 5g; rs = −0.91, P = 3 × 10−5 versus rs = 0,46, P = 0,11). Así, los animales con mayor ablación fueron los de peor rendimiento el día 8, y los de mejor rendimiento el día 9, y viceversa. Estos resultados confirman la participación de EC-6b tanto en la formación de memorias espaciales nuevas como en la retención de memorias espaciales antiguas.

Nuestros resultados demuestran que las neuronas en la capa entorrinal más profunda, que coinciden con el perfil molecular21,22,23, morfológico26,27 y electrofisiológico47 de la capa cortical 6b, se proyectan a todas las subregiones del hipocampo y probablemente parahipocampal, mientras exhiben el patrón de conectividad bidireccional característico. con núcleos talámicos, informado previamente para los SPN en el cerebro neonatal26,48,49,50 (Figs. 1–3 y Figs. Suplementarias 1, 2). Por lo tanto, múltiples líneas de evidencia sugieren que las neuronas EC-6b que proyectan el hipocampo que identificamos en el cerebro adulto corresponden a una población persistente de SPN. Este es un hallazgo inesperado, no solo porque la existencia de tales células en la CE no se informó previamente, sino más aún porque se cree que las capas más profundas procesan y redistribuyen selectivamente la producción del hipocampo2,3.

Los SPN son las primeras neuronas generadas durante el desarrollo embrionario, en E11.5–E12.529 y se acepta ampliamente que tienen un papel destacado en varios procesos asociados con el desarrollo cortical, como la migración celular, la diferenciación y el cableado de las capas corticales24 ,51,52,53. De acuerdo con esta función propuesta, se asume ampliamente que los SPN mueren poco después de que se completa la corticogénesis, presumiblemente por muerte celular programada24,25,54. Sin embargo, hay evidencia acumulada de que las subpoblaciones de SPN, preferentemente aquellas que expresan Cplx3 y Ctgf, persisten hasta la edad adulta18,22,26,55, y nuestros resultados confirman y amplían estos hallazgos previos. La contribución de los SPN al desarrollo cortical y de la capa 6b a la dinámica del circuito en el adulto puede no ser mutuamente excluyente y será interesante examinar las posibles interacciones entre los dos procesos en el futuro.

Desde el trabajo clásico de Santiago Ramón y Cajal56, el circuito EC-hipocampo a menudo se ve como un bucle trisináptico, en el que los elementos principales del circuito están conectados linealmente. Si bien se realizaron adiciones menores, el esquema básico de conectividad no se ha cuestionado5. Nuestros resultados identifican una nueva conexión en este circuito bien establecido. Aunque el número de neuronas EC-6b es mucho menor que el de las neuronas EC-2/3, las propiedades funcionales y estructurales únicas convergen para dotar a estas neuronas de una influencia desproporcionada en relación con su número. Primero, el EPSC muestra un decaimiento lento y una depresión sináptica absoluta, lo que lleva a EPSP similares a una meseta en las células objetivo postsinápticas, cuyo inicio se sincroniza con el primer evento de pico en una ráfaga determinada (Fig. 4d, p). En segundo lugar, las neuronas EC-6b reciben información convergente de múltiples fuentes, sobre todo el claustrum, un centro cortical central y altamente interconectado57 (Fig. 3), y se dirigen a todas las subregiones que comprenden el HF (Fig. 1d). Por último, un alto grado de interconectividad entre los SPN, mediada por sinapsis tanto químicas como eléctricas, observada en la corteza en desarrollo53,58,59 podría persistir hasta la edad adulta, lo que permite que una pequeña cantidad de SPN interconectados sincronicen la actividad en las subregiones del córtico-hipocampo. En conjunto, estas propiedades únicas pueden explicar el poderoso papel de estas neuronas en el comportamiento e insinuar una función uniformemente importante en la placa cortical.

Varios mecanismos pueden explicar la lenta descomposición de los EPSC EC-6b-CA3. Es posible que la cinética del receptor de glutamato contribuya al curso lento del tiempo, aunque las diferentes cinéticas de las entradas de EC-2 y EC-6b, que terminan en las dendritas distales de los mismos tipos de células, pueden argumentar en contra de esta posibilidad. Alternativamente, la liberación asíncrona del transmisor, el desbordamiento del transmisor y la transmisión de volumen podrían desempeñar un papel. Es interesante observar que las neuronas EC-6b muestran similitudes con las células neurogliaformes GABAérgicas Ndnf+37, en particular con respecto al curso lento de los eventos sinápticos60 y la expresión de la proteína sináptica CPLX3, que no se expresa en ningún otro tipo de célula cortical (Fig. 4). Se necesita más trabajo para comparar los dos tipos de sinapsis a nivel unitario.

Nuestros resultados sugieren que EC-6b contribuye a la codificación espacial y la formación de memoria en el hipocampo. El silenciamiento optogenético agudo de las neuronas EC-6b profundas condujo a una disminución aguda en el SI de las neuronas piramidales CA1 (Fig. 5a-c), con solo una reducción mínima en la frecuencia de activación promedio (Fig. 10 complementaria). Por lo tanto, los efectos de la inhibición optogenética difieren de los observados después de la manipulación aguda o crónica de las neuronas EC de la capa superficial, que hasta el momento han dado como resultado solo cambios menores en SI6,7,8,9,10,11. Además, los efectos también difieren de los de la inhibición optogenética aguda de la proyección CA3-CA1, que conducen a una marcada disminución en las tasas de activación, pero a un aumento en SI en las neuronas piramidales CA161. Es posible que la salida divergente de las neuronas de la capa 6b afecte la coherencia de los picos en la red del hipocampo, lo que contribuye a la sincronización de las neuronas principales en el rango de frecuencia lento delta (0,5 a 3 Hz) y theta (3 a 8 Hz). De acuerdo con este modelo, los patrones de activación específicos del lugar podrían surgir y estabilizarse como resultado de una activación de redes débil, pero altamente orquestada, que abarca todas las subregiones del hipocampo. En el CA1, se ha demostrado que los potenciales de meseta como los que observamos después de la estimulación de la proyección de EC-6b a CA3 subyacen a la formación de campos de lugar44,45 y, más recientemente, memorias asociativas62, lo que brinda apoyo adicional a esta hipótesis. Las grabaciones de unidades múltiples de EC-6b mostraron previamente que los subconjuntos de células mostraban patrones de disparo en forma de cuadrícula17. Por lo tanto, la conexión de la capa 6b con el hipocampo puede proporcionar una explicación para las observaciones anteriores de que los campos de lugar del hipocampo pueden surgir antes y en ausencia de la actividad de las células de la cuadrícula EC-28,63,64.

Para investigar la contribución de las neuronas EC-6b a la formación de la memoria espacial, diseñamos un experimento utilizando el sistema Intellicage, que nos permite controlar de manera simultánea y diferencial la ubicación de una recompensa de agua para una cohorte de animales co-alojados, dentro de su jaula. y sin la presencia física de un experimentador. Este diseño, que imita de alguna manera la situación en un hábitat natural, reveló un efecto dual de la ablación de la capa 6b en la memoria espacial: mientras que la ablación perjudicó la capacidad de aprender nuevas ubicaciones de recompensa, también afectó la capacidad de olvidar ubicaciones anteriores.

La manipulación utilizada para apuntar a las neuronas EC-6b fue eficiente para maximizar la cantidad de células afectadas en esta capa, lo que nos permitió observar efectos sólidos en una tarea de comportamiento. Sin embargo, dado que la manipulación no fue específica de EC, también puede haber estado involucrada la ablación de las neuronas de la capa 6b en otras áreas corticales. Aunque se pueden descartar los déficits motores o sensoriales, ya que darían lugar a una disminución del rendimiento conductual independiente de la ubicación, no se pueden excluir efectos de red más complejos más allá de la EC. Estos podrían surgir de alteraciones en la actividad en la corteza prefrontal, que previamente se demostró que está involucrada en tareas espaciales que requieren flexibilidad cognitiva65,66 (pero también ver ref. 67). Sin embargo, dado que la tarea conductual tiene un componente espacial importante, que probablemente involucra el eje EC-hipocampo, la explicación más parsimoniosa es que las neuronas de la capa entorrinal 6b desempeñan un papel fundamental en estos efectos conductuales. Incluso en el escenario improbable en el que se demuestre que los efectos conductuales observados requieren solo la corteza prefrontal, sin la participación de la formación del hipocampo, nuestros hallazgos aún deberían tener relevancia ya que, hasta la fecha, no se ha asignado ninguna función conductual o cognitiva a las células. de la capa 6b en cualquier región cortical.

Aunque este efecto bidireccional pueda parecer paradójico, se ha sugerido que la degradación de la memoria es un proceso mnemotécnico activo e igualmente adaptativo como la codificación de la memoria y que una capacidad reducida para olvidar también debería considerarse un déficit de memoria68. Estos hallazgos plantean la interesante posibilidad de que estos dos procesos opuestos no solo estén relacionados, sino que surjan de los patrones de actividad de una sola población de neuronas, capaces tanto de sincronizar como de desincronizar la actividad en los circuitos del hipocampo.

Concluimos que las neuronas de la capa entorrinal 6b son fundamentales para el correcto funcionamiento del hipocampo de roedores adultos, incluida la codificación espacial y la memoria. Las neuronas de la capa 6b en otras regiones corticales pueden tener funciones similares, lo que implica un papel general en los cálculos de redes complejas de todo el cerebro. Dado que la capa de subplaca está muy conservada en las especies de mamíferos y parece estar más desarrollada en el cerebro humano69,70,71, nuestros hallazgos podrían extrapolarse potencialmente más allá del organismo modelo. El trabajo futuro identificará la contribución de las neuronas de la capa 6b a las funciones del circuito superior del cerebro humano en la salud y la enfermedad.

Se usaron células HEK293-GT y BHK-eT para rescatar, seudotipificar y amplificar los vectores virales de la rabia RVdG-CVS-N2c según un enfoque publicado previamente12. En resumen, las células HEK293-GT que expresan de manera estable la glicoproteína optimizada SAD B19 y una polimerasa de ARN T7 optimizada se transfectaron con el vector plásmido RVdG-CVS-N2c junto con los plásmidos auxiliares SADB19 pTIT-N, pTIT-P y pTIT-L usando polietilenimina. (PEI). Una vez que todas las células del cultivo se marcaron con fluorescencia, generalmente 5 a 6 días desde el momento de la transfección y 1 a 2 días desde el momento en que se detectó la fluorescencia por primera vez, el medio se recolectó, filtró, dividió en alícuotas y una pequeña cantidad (100 a 200 µl ) se transfirió a placas que contenían células BHK-eT, que expresan de manera estable la glicoproteína envA y el receptor TVA, para la pseudotipificación y amplificación simultáneas de los vectores. Los vectores pseudotipados se recogieron diariamente durante un período de tres días, comenzando en el día 3 de la transducción y el virus se agrupó y centrifugó a 70 000 × g durante 1,5 h. Después de la centrifugación, se aspiró el medio y el sedimento viral se resuspendió en 200 µl de solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4, se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 °C hasta su uso. El título final de los vectores virales de la rabia RVdG-CVS-N2c seudotipados se determinó mediante la transducción en serie de HEK293-TVA y se calculó mediante una fórmula publicada previamente72. Para obtener una lista completa de los plásmidos RVdG-CVS-N2c utilizados en este estudio, consulte la Tabla complementaria 2.

La producción de AAV se realizó en células HEK293T según un protocolo publicado previamente73. Brevemente, se transfectaron células HEK293 completamente confluentes con un vector plásmido AAV2 junto con pAdenoHelper y los plásmidos AAV-dj RepCap usando PEI. Treinta y seis horas después de la transfección, las células se recogieron, sedimentaron y lisaron utilizando tres ciclos de congelación-descongelación. Las células lisadas se incubaron con benzonasa-nucleasa (Sigma-Aldrich) durante 1 h y luego los desechos se sedimentaron y el sobrenadante que contenía el virus se recogió y se pasó a través de un filtro de 0,22 µm. El sobrenadante recogido se mezcló posteriormente con una cantidad igual de heparina-agarosa (Sigma-Aldrich) y se mantuvo a 4 °C durante la noche con agitación constante. Al día siguiente, la mezcla de agarosa-virus se transfirió a una columna de cromatografía y se dejó sedimentar la agarosa. A continuación, el sobrenadante se drenó de la columna por gravedad y el virus unido a agarosa se lavó una vez con PBS y luego se eluyó usando PBS suplementado con NaCl 0,5 M. Luego, el virus eluido se filtró nuevamente, se desalinizó y se concentró usando un filtro centrífugo de 100 kDa y luego se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 ° C hasta su uso. Para obtener una lista completa de los plásmidos AAV utilizados en este estudio, consulte la Tabla complementaria 2.

Todas las líneas de ratones transgénicos utilizadas en este estudio se han caracterizado previamente (Tabla complementaria 3). En todos los experimentos, se utilizaron indistintamente ratones machos y hembras en cantidades iguales, en un rango de edad que varió entre 1 y 6 meses. En los experimentos de comportamiento, se observaron efectos ligeramente mayores de TMP en las hembras, probablemente debido a un efecto más sólido de TMP, pero esta observación no se continuó. Los experimentos en ratones C57BL/6 de tipo salvaje y transgénicos se realizaron en estricta conformidad con las directrices institucionales, nacionales y europeas para la experimentación con animales y fueron aprobados por el Bundesministerium für Wissenschaft, Forschung und Wirtschaft y Bildung, Wissenschaft und Forschung, respectivamente, de Austria. (A. Haslinger, Viena; BMWF-66.018/0010-WF/V/3b/2015; BMBWF-66.018/0008-WF/V/3b/2018).

Para la administración in vivo de vectores virales, los ratones se anestesiaron con isoflurano, se les inyectó buprenorfina 0,1 mg kg−1 y se colocaron en un marco estereotáxico donde continuaron recibiendo 1–5 % de isoflurano vaporizado en oxígeno a un caudal fijo de 1 l. min−1. Se probaron los reflejos de retirada de las piernas para evaluar la profundidad de la anestesia y, cuando no se observó ningún reflejo, se hizo una incisión en el cuero cabelludo para exponer el cráneo. A continuación, se localizó Bregma y se utilizaron sus coordenadas como referencia para las coordenadas anterior-posterior (AP) y medio-lateral (ML), mientras que la superficie de la duramadre en el lugar de la inyección se utilizó como referencia para las coordenadas dorso-ventrales (DV). En nuestros experimentos, utilizamos los siguientes conjuntos de coordenadas AP/ML/DV (en mm): DG: −1,9/1,3/−1,9; CA3: −1,9/±2,5/−2; CA1: −1,9/1,5/−1,2; IN del hipocampo: −1,9/1,8/−1,6; CE: −4/3,5/−3. Los vectores AAV primero se diluyeron 1:5 en PBS y se administraron en el sitio de inyección a un volumen de 0,3 µl y una velocidad de 0,06 µl por minuto, usando una jeringa Hamilton y una aguja 32G. Una vez que se completó la inyección, la aguja se dejó en su lugar durante 1 a 2 minutos adicionales para permitir que el virus se difundiera en el tejido y luego se retrajo lentamente. Al final de la sesión de inyección, se pegó el cuero cabelludo hacia atrás y se devolvió a los ratones a su jaula para que se recuperaran. La inyección de vectores virales de la rabia seudotipados se llevó a cabo de 2 a 3 semanas después de la inyección inicial de vectores AAV que contenían el receptor TVA y la glicoproteína de la rabia. Los vectores de rabia pseudotipados se diluyeron primero para alcanzar una concentración final de ~2–5 × 108 TU ml−1 y luego se inyectaron de la misma manera que el AAV. Excepto por las inyecciones de rabia en el DG de Prox1-cre o EC de animales transgénicos Ctgf-2A-dgCre, todas las demás inyecciones de virus de la rabia se desplazaron -0,2 mm AP y -0,2 mm ML. Esto se hizo para evitar, en la medida de lo posible, un marcaje no específico a lo largo del trayecto de la aguja de la primera inyección, debido a la falta de especificidad completa de la expresión de Cre-recombinasa en los transgénicos KA1-cre y DLX5/6-Flp. líneas.

Los registros electrofisiológicos de las células marcadas retrógradamente identificadas se realizaron de 5 a 7 días después de la inyección de vectores CVS-N2c. Los animales manipulados se anestesiaron con una mezcla de MMF que constaba de medetomidina (0,5 mg kg-1), midazolam (5 mg kg-1) y fentanilo (0,05 mg kg-1) y se perfundieron transcardiacamente con 20 ml de solución de disección helada que contenía 87 mM NaCl, NaHCO3 25 mM, KCl 2,5 mM, NaH2PO4 1,25 mM, D-glucosa 10 mM, sacarosa 75 mM, CaCl2 0,5 mM y MgCl2 7 mM (pH 7,4 en 95 % O2/5 % CO2, 325–327 mOsm). Luego se extrajo el cerebro y se diseccionó el hipocampo junto con el tejido cortical adyacente y se colocó en un molde prefabricado hecho de agarosa al 4% diseñado para estabilizar el tejido. El molde se transfirió a la cámara de un vibratomo VT1200 (Leica Microsystems) y el tejido se seccionó transversalmente en rebanadas de 350 µm de espesor en presencia de una solución de corte helada. Se permitió que los cortes cortico-hipocampales transversales se recuperaran durante ~30 min a ~31 °C y luego se mantuvieron a temperatura ambiente (TA, 22 ± 1 °C) durante la duración de los experimentos. Durante los registros, los cortes se superfundieron con una solución de registro que contenía NaCl 125 mM, KCl 2,5 mM, NaHCO3 25 mM, NaH2PO4 1,25 mM, D-glucosa 25 mM, CaCl2 2 mM y MgCl2 1 mM (pH 7,4 en O2 al 95 %/O2 al 5 %). CO2, 316 mOsm), a una velocidad de ~1 ml min−1 usando flujo por gravedad. Las neuronas en las regiones de interés se parchearon usando pipetas de parche que contenían: K-gluconato 125 mM, KCl 20 mM, EGTA 0,1 mM, fosfocreatina 10 mM, MgCl2 2 mM, Na2ATP 2 mM, Na2GTP 0,4 mM, HEPES 10 mM (pH ajustado). a 7,28 con KOH, ~300 mOsm); Se añadió biocitina al 0,3 % en un subconjunto de registros. Las células parcheadas se mantuvieron en modo de pinza de corriente en el potencial de membrana en reposo de la neurona. Las señales de las células parcheadas se adquirieron usando un amplificador Axon Axopatch 200 A (Molecular Devices) y se digitalizaron usando un convertidor de analógico a digital CED Power 1401 (Cambridge Electronic Design). La estimulación optogenética se administró mediante un LED blanco con filtro azul a una intensidad de 4,5 mW mm−2 (Prizmatix, IL), pasado a través de un objetivo ×63 colocado sobre la neurona registrada. Para todas las grabaciones, se emitieron de 2 a 5 pulsos de luz de 5 ms de duración a una frecuencia de 10 Hz, con un intervalo de 20 s entre estimulaciones. Para el aislamiento de las corrientes mediadas por los receptores AMPA y NMDA, utilizamos una solución interna basada en CsCl compuesta por CsCl 145 mM, HEPES 10 mM, MgCl2 2 mM, fosfocreatina 5 mM, Na2ATP 2 mM, Na2GTP 0,3 mM y QX-314 5 mM. (pH ajustado a 7.28 con KOH, ∼310 mOsm), junto con los siguientes agentes farmacológicos: Gabazina 100 µM, CNQX 25 µM y D-AP5 50 µM aplicados en diferentes etapas del registro. Al final de cada sesión de registro, el electrodo se retrajo lentamente para formar un parche de afuera hacia afuera. Posteriormente, la rebanada se retiró de la cámara de grabación, se sumergió en paraformaldehído (PFA) al 4% y luego se mantuvo en tampón fosfato (PB) 0,1 M hasta su posterior procesamiento. Los análisis posteriores de EPSC y las propiedades de la membrana se realizaron con Stimfit (versión 0.15.8; https://github.com/neurodroid/stimfit)74 y las trazas representativas se procesaron y visualizaron con Igor Pro 6 (Wavemetrics, OR, EE. UU.).

Con fines de obtención de imágenes, los animales se sacrificaron entre 5 y 7 días después de la inyección de los vectores RVdGenvA-CVS-N2c. En primer lugar, los animales se anestesiaron como se describe en la sección anterior y se perfundieron transcardiacamente con 15 ml de PB 0,1 M seguido de 30 ml de PFA al 4%. Después de la perfusión, se extrajo el cerebro y se mantuvo en PFA al 4 % durante la noche a 4 °C, que posteriormente se reemplazó con PB 0,1 M. Los cerebros fijados se seccionaron con un grosor de 100 µm en un plano coronal, parasagital o transversal y se almacenaron en PB 0,1 M a 4 °C.

Para el marcaje inmunohistoquímico del tejido transducido, se usaron protocolos estándar. Primero, las secciones se lavaron con PB 3 veces durante 10 min. A continuación, las secciones se incubaron con suero normal de cabra al 10 % (NGS) y Triton X-100 al 0,3 % durante 1 h, a temperatura ambiente con agitación constante y, posteriormente, con anticuerpos de conejo contra CPLX3 (Synaptic Systems, Cat#122 302, 1:500) , en PB que contiene 5 % de NGS y 0,3 % de Triton X-100, a 4 °C durante la noche. Después del lavado, los cortes se incubaron con anticuerpos secundarios específicos de isotipo (anticonejo de cabra conjugado con Alexa Fluor 488 o 647) en PB que contenía NGS al 5 % y Triton X-100 al 0,3 % durante 2 h en temperatura ambiente con agitación constante. Después de lavar una vez más, se montaron los cortes, se incluyeron en medio de montaje Prolong Gold Antifade (Thermo-Fisher Scientific, Cat# P36930) y se sellaron con un cubreobjetos de 0,17 mm. Para el doble marcaje de CPLX3 con VGLUT1 o VGAT, se usaron anticuerpos de cobayo (Synaptic Systems, Cat# 135304 y 131004, respectivamente, 1:200) y para el marcaje de PCP4 y NeuN, se usaron anticuerpos de conejo (Novus Biologicals, Cat# NBP1-80929 y NBP1-92693 respectivamente, 1:500). Para la adquisición de imágenes STED, utilizamos anticuerpos secundarios anti-rabbit Star580 y anti-cobaya Star635P (Abberior, Alemania, 1:200).

Las neuronas que estaban llenas de biocitina (0,3%) se procesaron para el análisis morfológico. Después de retirar las pipetas, lo que resultó en la formación de parches de afuera hacia afuera en las puntas de las pipetas, las rebanadas se fijaron durante 12 a 24 horas a 4 °C en una solución de PB 0,1 M que contenía PFA al 4 %. Para la reconstrucción de la morfología dendrítica, los cortes fijados se trataron con estrepdavidina conjugada con Alexa-Fluor 647 (Invitrogen, Cat# S32357: 1:200) junto con NGS al 5 % y Triton X-100 al 0,4 % durante aproximadamente 2 h seguido de 3 ciclos de lavado. en PB. A continuación, las secciones teñidas se montaron en un portaobjetos, se incluyeron en Mowiol (Sigma-Aldrich) y se sellaron con un cubreobjetos de 0,17 mm.

Un ratón adulto de tipo salvaje (P60) se sacrificó por decapitación y su cerebro se extrajo rápidamente, se fijó en PFA frío al 4 % durante 4 h, seguido de una incubación adicional de 24 h en una solución fría de sacarosa al 30 %. A continuación, el cerebro se incrustó en un compuesto de temperatura de corte óptimo (OCT, Tissue-Tek), se congeló con hielo seco y se cortó en secciones de 16 µm con un criostato (Leica CM1950, Leica Biosystems). Primero, las secciones se fijaron con PFA al 4 % durante 15 min, se lavaron con PBS y se deshidrataron usando un gradiente ascendente de EtOH (25 %, 50 %, 75 % y 100 %, cada paso durante 5 min con secado posterior durante 15 min) . Luego, los cortes se tiñeron de acuerdo con el protocolo del fabricante75 (Molecular Instruments), con DAPI suplementado antes del montaje. Las sondas ISH para la detección de Cplx3 y Ctgf (también denominadas Ccn2) fueron diseñadas comercialmente por el fabricante.

Las imágenes confocales se adquirieron usando un microscopio LSM 800 (Zeiss). Se adquirió un subconjunto de muestras de tejido aclaradas utilizando el microscopio confocal de disco giratorio Andor Dragonfly (tecnologías Andor). Todas las imágenes confocales representativas que se muestran en este manuscrito se muestran como una proyección de máxima intensidad de una pila de imágenes de 4 a 12 imágenes separadas. Para obtener imágenes del tejido intacto, la placa cortical, que contiene el hipocampo y el EC adyacente, se extrajo del hemisferio transducido y posteriormente se limpió utilizando el método CUBIC76. Una vez que el tejido apareció translúcido, se montó en una cámara todavía sumergida en la solución CUBIC, se presionó ligeramente para aplanar el tejido y se cubrió con un cubreobjetos. Luego, el tejido aclarado se transfirió al microscopio confocal con el lado CA3 hacia arriba, donde se tomaron imágenes durante la noche. Para todas las imágenes utilizadas en este manuscrito, la posible diafonía entre canales se controló de cerca y se descartó antes del análisis de la superposición de señales.

La microscopía STED de dos colores se realizó en un microscopio STED invertido comercial (Abberior Instruments, Alemania) con excitación pulsada y láseres STED. Se utilizó un láser de 561 nm y de 640 nm para la excitación y un láser de 775 nm para el agotamiento de la emisión estimulada. Para la adquisición de imágenes se utilizó un objetivo de inmersión en aceite con apertura numérica 1.4 (UPLSAPO 100XO, Olympus, Japón). La señal de fluorescencia se recolectó en un arreglo confocal con un tamaño de orificio de 0,6 unidades aireadas usando fotodiodos de avalancha de conteo de fotones con filtros de paso de banda de 605/50 nm y 685/70 nm para detección STAR 580 o STAR 635P, respectivamente. La tasa de repetición de pulsos fue de 40 MHz y la detección de fluorescencia fue controlada por tiempo. Los parámetros de imagen utilizados para adquirir imágenes STED de dos colores fueron un tiempo de permanencia de píxeles de 15 μs, una potencia de láser de excitación de ~4,5 μW (561 nm) y ~3,8 μW (640 nm) y una potencia de láser STED de ~75 mW. Los canales se adquirieron consecutivamente como pasos de línea con acumulaciones de dos líneas para cada canal. Para las imágenes de 3 colores, se registró la misma región de interés con un tercer canal de color con resolución limitada por difracción utilizando un láser de 488 nm con un tiempo de permanencia de 25 μs y una potencia de excitación de ~40 μW. En este caso, se utilizó un tamaño de agujero de alfiler de 1,0 unidad aireada y acumulaciones de 2 líneas. La señal se recolectó usando un fotodiodo de avalancha de conteo de fotones con un filtro de paso de banda de 525/50 nm. El tamaño de píxel fue de 40 nm para todas las imágenes. Los valores de potencia se refieren a la potencia en la apertura trasera del objetivo. Las imágenes del SM del hipocampo se tomaron de las regiones correspondientes a las proyecciones del MEC, es decir, la capa molecular medial del DG, CA3 y CA2, la capa molecular proximal del CA1 y el SM distal del subículo.

La cuantificación del número de células en la preparación de tejido aclarado, así como la cuantificación de la colocalización en secciones finas, se realizó utilizando el software Imaris (Oxford Instruments) con una distancia máxima para la colocalización establecida en 2 µm. El análisis de la colocalización de terminales para imágenes STED se realizó utilizando Fiji ("Fiji es solo ImageJ")77 a través de un script escrito a medida (https://github.com/sommerc/coloco3surf). Para ello, se creó una máscara para cada uno de los canales individuales tras el ajuste manual del umbral, descartándose las superficies inferiores a 0,1 µm2. A continuación, se calculó la densidad de señal de cada canal como la relación entre el número total de píxeles de la máscara y el número total de píxeles de la imagen. A continuación, se creó una nueva máscara, que contenía solo píxeles superpuestos de los dos canales, con superficies menores de 0,1 µm2 nuevamente descartadas y la densidad calculada como se describe para las máscaras primarias.

A los ratones Ctgf-2A-dgCre//Ai40 se les administró TMP 150 mg kg-1 para impulsar la expresión de ArchT-GFP en las neuronas EC-6b. 2–3 días después de la inducción con Cre, se implantaron en los animales 6 tetrodos móviles independientes, que rodeaban una fibra óptica (diámetro del núcleo de 240 μm, 0,63 NA, punta cónica de 45°; lentes dóricos), bajo anestesia profunda con isoflurano (0,5–3 % ), oxígeno (1-2 l min−1) y una dosis inicial de buprenorfina (0,1 mg kg−1). Los tetrodos se construyeron a partir de cuatro cables de tungsteno de 12 μm correspondientemente (aislamiento H-Formvar con capa adhesiva de butiral, California Fine Wire, Grover Beach CA), retorcidos y luego calentados para unirlos en un solo paquete. Luego, las puntas se enchaparon en oro para reducir la impedancia de sus electrodos a 200–400 kΩ. Durante la cirugía, se centró una craneotomía sobre el CA1 dorsal y se implantó la punta de la fibra óptica en las siguientes coordenadas: −1,9 mm AP y 1,6 mm ML desde bregma y −1,2 mm desde la superficie pial. Las puntas de los tetrodos se colocaron inicialmente ~300 µm por encima de la punta de la fibra. Dos tornillos colocados sobre el cerebelo sirvieron como electrodos de tierra y de referencia. Se usaron dos tornillos de anclaje de acero inoxidable adicionales para unir de forma permanente el ensamblaje del microimpulsor al cráneo. Los electrodos recubiertos de cera de parafina y el aparato de microimpulsor se embadurnaron con acrílico dental para revestir el conjunto de electrodos y microimpulsor y anclarlo a los tornillos en el cráneo. Después de un período de recuperación de 7 días, los tetrodos se bajaron en pasos de 50 a 150 μm cada día en la región CA1 durante un período adicional de 7 a 14 días.

Los datos extracelulares se adquirieron utilizando el sistema de evaluación Intan RHD2000 y un headstage RHD2132 (Intan Technologies, CA, EE. UU.) junto con una versión extendida del software Ktan (https://git.ist.ac.at/alois.schloegl/ktan. git). La señal eléctrica se muestreó a 20 kHz. La trayectoria se rastreó con una cámara de video (FL-HC0614-2M; RICOH) que grabó dos luces LED conectadas al escenario principal y se registró con el software Positrack (https://github.com/kevin-allen/positrack). La extracción de picos se realizó mediante la implementación del software Mountainsort78 y se utilizó un software personalizado para la limpieza y el refinamiento de grupos (https://github.com/igridchyn/lfp_online). La luz verde para la activación de ArchT fue proporcionada por un LED verde de 535 nm a 2,5 mW mm−2 (Prizmatix, IL). La fuente de luz se acopló a un latiguillo de fibra óptica de 0,48 NA (4,5 m de largo, 0,37 NA; lentes dóricas), que transmitía la luz al micromotor. Los pulsos de luz se activaron con pulsos TTL enviados a través del puerto paralelo de la computadora, ejecutando el software de adquisición y decodificación de señales en tiempo real.

Para el análisis de datos, el entorno de campo abierto se dividió en 15 × 15 contenedores espaciales de igual tamaño de aproximadamente 11,1 cm2 cada uno. Usando el seguimiento posicional, se generó un mapa de ocupación calculando la cantidad de tiempo que el animal pasó en cada contenedor espacial durante los períodos de carrera (filtro de velocidad> 3 cm s-1). Luego se contó el número de picos que disparó una celda en cada contenedor espacial (también filtrada por velocidad, >3 cm s−1) y se dividió por el tiempo de ocupación. Luego, los mapas de tasas se suavizaron con un filtro gaussiano con una desviación estándar de 1 bin. Para medir la sintonía espacial de las células, se calculó la medida SI79. Solo se incluyeron en este análisis las células con una tasa de activación media entre 0,2 y 5 Hz, lo que constituye células piramidales putativas. Además, las celdas debían tener una tasa de disparo de al menos 0,2 Hz tanto en los primeros como en los últimos 15 minutos de la grabación para garantizar la inclusión de solo celdas registradas de manera estable. Para cada celda, el mapa de tasas se dividió en cuatro cuadrantes de igual tamaño. El SI se calculó por separado para cada cuadrante y se comparó el SI promedio entre los cuadrantes de luz y no luz. Utilizamos la siguiente definición:

donde λx es la tasa de activación media en el intervalo espacial x, λ la tasa de activación media en todo el entorno y P la ocupación79.

Para evaluar la contribución de las neuronas EC-6b a la memoria espacial, cruzamos ratones Ctgf-2A-dgCre y RosaStopDTA para permitir la ablación condicional de la capa de la subplaca. Se cree que los ratones RosaStopDTA inducen una ablación celular altamente específica, porque los ratones carecen de un receptor funcional para la toxina diftérica y el DTA carece de la subunidad B necesaria para la penetración de las membranas celulares80. Crías dobles transgénicas masculinas y femeninas de 2 a 5 meses de edad, se implantaron por vía subcutánea con un transpondedor identificador y 1 semana después se colocaron en un entorno inteligente (TSE-Systems, Alemania): hasta 8 ratones simultáneamente del mismo sexo, con una temperatura constante , un ciclo de luz de 12 h y acceso ad libitum a los alimentos. Al ingresar al intellicage, los animales se sometieron a un período de habituación de 5 días, durante el cual todos los puertos de agua estuvieron disponibles y gradualmente aprendieron cómo acceder a la botella de agua luego de un retraso de 10 s desde el momento en que la nariz entró en el puerto. A continuación, cada animal fue asignado aleatoriamente a un puerto de agua individual, de los ocho disponibles en cada jaula, por un período de 5 días. Al final de este período de entrenamiento inicial, los animales se dividieron aleatoriamente en el grupo experimental, al que se les administró ip 150 mg g-1 de TMP, y un grupo de control inyectado con un vehículo. La tasa de error individual se midió como la relación entre los morros al puerto asignado y el número total de morros durante un período de 24 horas. Los ratones que no lograron alcanzar una tasa de error inferior al 70 % el último día del período de aprendizaje inicial se excluyeron del estudio y de todos los análisis posteriores. Inmediatamente después de esta manipulación, los ratones se colocaron de nuevo en su inteligencia y se les asignó un puerto de agua diferente, durante un período de 3 días. Después de tres rotaciones de este tipo, todas consistentes en cambios idénticos tanto en la esquina como en el costado, los animales fueron asignados nuevamente a su puerto de agua original, que les fue asignado antes de la manipulación, por un período adicional de 5 días. Al final de este ensayo, los animales se retiraron de la jaula, se perfundieron transcardiacamente con PFA al 4% en PB y los cerebros del grupo experimental se seccionaron a 100 µm para un análisis adicional de la densidad sináptica de CPLX3. Aparte de la administración de TMP o vehículo, no se hizo ningún contacto directo o indirecto con los animales.

Todos los valores se informaron como medias y barras de error como ± SEM. La significación estadística se probó mediante una prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis de un solo lado, seguida de una prueba de Mann-Whitney de dos lados para comparaciones post hoc, o mediante la prueba exacta de Fisher para el análisis de las diferencias en las proporciones de los grupos. Las comparaciones múltiples se ajustaron mediante la corrección de Holm-Bonferroni. Las imágenes confocales utilizadas como representación se replicaron con éxito en más de diferentes animales, con resultados idénticos. Para el análisis de los datos de inteligencia, utilizamos una prueba ANOVA de tres vías de transformación de rango alineado no paramétrica de un solo lado para comparar las sesiones A, D y A*81 y una prueba de Friedman no paramétrica de un solo lado para examinar el curso del tiempo de aprendizaje. . Los cálculos se realizaron en Microsoft Excel, Python o R (versión 4.1.0). Se consideraron significativas las diferencias estadísticas con p < 0,05. En las cifras, un asterisco simple (∗), asteriscos dobles (**) y asteriscos triples (***) indican p < 0,05, p < 0,01 y p < 0,001, respectivamente, y se utilizan en todo el manuscrito.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los archivos de datos de imagen adicionales están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

El siguiente código personalizado se generó para este estudio y está disponible a través de los siguientes enlaces: Coloco3surf: https://github.com/sommerc/coloco3surf. Ktan—https://git.ist.ac.at/alois.schloegl/ktan.git. Las rutinas de análisis están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Descargar referencias

Agradecemos a F. Marr y A. Schlögl por la asistencia técnica, a E. Kralli-Beller por la edición del manuscrito, así como a C. Sommer y el Centro de Imágenes y Óptica del Instituto de Ciencia y Tecnología de Austria (ISTA) por los scripts de análisis de imágenes y soporte de microscopía. Extendemos nuestro agradecimiento a J. Wallenschus y D. Rangel Guerrero por la asistencia técnica en la adquisición de datos de una sola unidad y a I. Gridchyn por su ayuda con el agrupamiento de una sola unidad. Finalmente, también agradecemos a B. Suter por las discusiones, A. Saunders, M. Jösch y H. Monyer por leer de manera crítica versiones anteriores del manuscrito, C. Petersen por compartir protocolos de limpieza y a las Unidades de Servicio Científico de ISTA por su apoyo eficiente. . Este proyecto fue financiado por el Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea (subvención avanzada del ERC n.º 692692 a PJ) y el Fond zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung (Z 312-B27, premio Wittgenstein para PJ y I3600-B27 para JGD y PV).

Yoav Ben Simon

Dirección actual: Departamento de Neurofisiología y Farmacología, Universidad Médica de Viena, Viena, Austria

carol kaefer

Dirección actual: Departamento de Neuroinformática, Universidad de Radboud, Nijmegen, Países Bajos

Instituto de Ciencia y Tecnología de Austria (ISTA), Klosterneuburg, Austria

Yoav Ben-Simon, Karola Kaefer, Philipp Velicky, Jozsef Csicsvari, Johann G. Danzl y Peter Jonas

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YB concibió el proyecto, diseñó y realizó todos los experimentos, YB y PV adquirieron imágenes STED asesoradas por JGD, KK e YB analizaron datos de una sola unidad, JC proporcionó instalaciones y equipos para grabaciones de tetrodos, YB analizó los datos, YB y PJ escribieron el manuscrito, y PJ supervisó el proyecto. Todos los autores leyeron y comentaron el manuscrito.

Correspondencia a Yoav Ben-Simon.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Ben-Simon, Y., Kaefer, K., Velicky, P. et al. Una proyección excitatoria directa desde las neuronas de la capa entorrinal 6b al hipocampo contribuye a la codificación espacial y la memoria. Nat Comun 13, 4826 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32559-8

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Recibido: 11 Abril 2022

Aceptado: 03 agosto 2022

Publicado: 16 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32559-8

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