Un mecanismo epigenético para más de

May 20, 2023

Molecular Psychiatry volumen 27, páginas 4893–4904 (2022)Citar este artículo

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El miedo excesivo es un sello distintivo de los trastornos de ansiedad, una de las principales causas de la carga de la enfermedad en todo el mundo. Pruebas sustanciales respaldan el papel de los circuitos de la corteza prefrontal y la amígdala en la regulación del miedo y la ansiedad, pero los mecanismos moleculares que regulan su actividad siguen sin comprenderse bien. Aquí, mostramos que la regulación a la baja de la histona metiltransferasa PRDM2 en la corteza prefrontal dorsomedial mejora la expresión del miedo al modular la consolidación de la memoria del miedo. Además, mostramos que la caída de Prdm2 (KD) en las neuronas que se proyectan desde la corteza prefrontal dorsomedial a la amígdala basolateral (dmPFC-BLA) promueve una mayor expresión de miedo. Prdm2 KD en el circuito dmPFC-BLA también resultó en una mayor expresión de genes involucrados en la sinaptogénesis, lo que sugiere que Prdm2 KD modula la consolidación del miedo condicionado al modificar la fuerza sináptica en los objetivos de proyección de dmPFC-BLA. De acuerdo con una eficacia sináptica mejorada, encontramos que dmPFC Prdm2 KD aumentó la probabilidad de liberación glutamatérgica en el BLA y aumentó la actividad de las neuronas BLA en respuesta a las señales asociadas al miedo. Juntos, nuestros hallazgos proporcionan un nuevo mecanismo molecular para las respuestas de miedo excesivo, en el que PRDM2 modula el circuito dmPFC-BLA a través de cambios transcriptómicos específicos.

El miedo normal provoca respuestas adaptativas destinadas a escapar de eventos que amenazan la vida [1, 2]. Por el contrario, las respuestas excesivas al miedo se vuelven desadaptativas y son características de los trastornos relacionados con el miedo, como el trastorno de estrés postraumático y varios trastornos de ansiedad [3]. La patología de los procesos de memoria involucrados en el miedo aprendido puede conducir a respuestas conductuales amplificadas que no se extinguen a pesar de la ausencia de una amenaza relevante [4]. Identificar los circuitos neuronales y los mecanismos moleculares que subyacen a la memoria excesiva del miedo puede identificar las vías moleculares que pueden ser el objetivo de los tratamientos mecánicos.

La investigación que utiliza el condicionamiento del miedo ha identificado estructuras cerebrales involucradas en el procesamiento de la memoria del miedo [5, 6]. Entre estos, el complejo de la amígdala, que incluye la amígdala central (CeA) y la amígdala basolateral (BLA), es fundamental para el condicionamiento del miedo pavloviano [7]. El CeA está involucrado en la expresión de respuestas de miedo condicionadas, mientras que el BLA actúa como un sitio primario donde se forman y almacenan asociaciones entre estímulos condicionados e incondicionados [8]. La amígdala está ampliamente interconectada con la corteza prefrontal (PFC), una región del cerebro importante para la regulación de las emociones [9]. También se cree que la PFC, incluida la corteza prefrontal dorsomedial (dmPFC; corteza prelímbica y cingulada) y la corteza prefrontal ventromedial (infralímbica), participa en el procesamiento de la memoria del miedo [10, 11]. En particular, la activación de las proyecciones de la dmPFC a la BLA se ha asociado con la regulación de arriba hacia abajo de la expresión del miedo [12,13,14,15]. Sin embargo, los mecanismos moleculares que regulan la modulación de la ruta dmPFC -BLA del procesamiento de la memoria del miedo aún no se han entendido por completo.

La creciente evidencia apunta hacia un papel de los mecanismos epigenéticos en la regulación de los procesos de memoria del miedo [16, 17]. Las experiencias pasadas, incluidos los eventos estresantes, pueden conducir a un "proceso de reprogramación" a través de cambios en la expresión génica. Se cree que la regulación epigenética es un mecanismo clave que altera la transcripción y la traducción [18] de manera dependiente de la experiencia [19,20,21]. Por lo tanto, las desregulaciones amplias de la expresión génica mediadas por procesos epigenéticos pueden vincular la exposición al estrés traumático con el desarrollo de trastornos relacionados con el estrés.

Anteriormente encontramos que la regulación a la baja del dominio 2 que contiene histona metiltransferasa PR (PRDM2), por un historial de dependencia del alcohol, se asoció con un aumento de las respuestas al estrés. PRDM2 promueve el silenciamiento génico mediante la adición de un grupo metilo en la histona H3 lisina 9 [22]. PRDM2 está fuertemente enriquecido en el cerebro y se expresa selectivamente en las neuronas de la dmPFC, lo que sugiere un papel de esta enzima epigenética en la función neuronal [23]. En consecuencia, encontramos que la caída de Prdm2 (KD) en el dmPFC potenció la recaída inducida por el estrés a la búsqueda de alcohol [23]. Una creciente literatura indica un vínculo entre el consumo excesivo de alcohol y los trastornos relacionados con el miedo tanto a nivel conductual como neuronal [24,25,26,27,28]. Aquí, por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la deficiencia de Prdm2 en el dmPFC puede contribuir al desarrollo del miedo patológico al promover cambios en la expresión génica en los circuitos cerebrales relacionados con el miedo.

Para probar esta hipótesis, derribamos Prdm2 en el dmPFC de rata y evaluamos los efectos sobre la adquisición, expresión y extinción del miedo condicionado. Dado el papel crítico de las proyecciones de dmPFC al BLA en el miedo condicionado con señales [12, 13, 29, 30], luego usamos una estrategia específica de proyección para determinar si Prdm2 KD regula el miedo a través de esta vía neuronal. Luego utilizamos la purificación por afinidad ribosómica de traducción viral (vTRAP) con secuenciación de ARN de alto rendimiento (RNAseq) para identificar las consecuencias moleculares aguas abajo de Prdm2 KD de una manera específica del circuito. Debido a que este análisis identificó una amplia regulación al alza de las transcripciones que codifican proteínas involucradas en la regulación de la actividad sináptica, finalmente investigamos los efectos de Prdm2 KD en las entradas glutamatérgicas al BLA usando grabaciones de pinzamiento en cortes de amígdala y medimos la actividad de las neuronas dmPFC-BLA durante Pruebas de memoria de miedo con fotometría de fibra in vivo.

Se alojaron ratas Wistar macho adultas (200-225 g, Charles River, Alemania) en un ciclo de luz inversa con comida y agua ilimitadas. Los procedimientos se realizaron de acuerdo con el Comité Nacional para la investigación con animales en Suecia y fueron aprobados por el Comité de Ética Local para el Cuidado y Uso de Animales en la Universidad de Linköping.

En este estudio se utilizaron nueve lotes de ratas (N = 268). La agrupación de animales se asignó al azar. En el experimento 1 (n = 17 revueltos y 20 Prdm2 KD), se analizó la adquisición, expresión (después de 24 h) y extinción de la memoria del miedo en ratas. En el experimento 2 (revuelto: n = 12 y Prdm2 KD n = 12), se analizó la expresión de la memoria del miedo en ratas 1 semana después del condicionamiento, así como la generalización del contexto y la sensibilidad a los golpes en las patas. En el experimento 3 (n = 17 revueltos y 20 Prdm2 KD), replicamos el efecto del aumento de la expresión de miedo de Prdm2 KD 24 h después del condicionamiento del miedo con señales. Antes de someterse al condicionamiento del miedo, se analizó la ansiedad en las ratas en el EPM y la actividad locomotora. Los niveles de corticosterona en plasma se midieron al inicio del estudio, después del acondicionamiento y después de probar la expresión de la memoria del miedo. Una semana después de la prueba de expresión de miedo, se sacrificó a las ratas y se recolectó el dmPFC para el análisis de expresión génica. En el experimento 4 (revuelto: n = 20 y Prdm2 KD n = 18), las ratas se condicionaron al estímulo del miedo 1 semana antes de la KD mediada por virus de Prdm2 y se analizó la expresión del miedo un mes después de la cirugía. En el experimento 5 (revuelto: n = 12 y Prdm2 KD n = 12), se probó el reconocimiento de objetos novedosos en ratas. En el experimento 6 (revuelto: n = 20 y Prdm2 KD n = 19), se investigaron los efectos de Prdm2 KD en neuronas que se proyectan específicamente al BLA sobre la expresión de la memoria del miedo 24 h después del condicionamiento. En el experimento 7 (revuelto: n = 18 ratas; grupos de 3 dmPFC y Prdm2 KD n = 18 ratas; grupos de 3 dmPFC), usamos vTRAP para analizar la expresión génica después de Prdm2 KD específicamente en las neuronas que se proyectan desde el dmPFC al BLA . En el experimento 8 (revuelto: n = 14 células de 5 ratas y Prdm2 KD n = 15 células de 6 ratas) usamos electrofisiología ex vivo para investigar los cambios en la liberación de glutamato a las neuronas BLA después de Prdm2 KD. Finalmente, en el experimento 9 (codificado: n = 9 y Prdm2 KD n = 13) usamos fotometría de fibra in vivo para investigar más a fondo las consecuencias de Prdm2 KD en el BLA. En la figura complementaria S1 se proporciona una descripción general de los experimentos realizados en este estudio.

Durante el condicionamiento del miedo, las ratas se acondicionaron en una cámara con señales visuales y olfativas específicas y se expusieron a seis intentos de choques de pie de 2 s y 1 mA asociados con un tono de aviso neutro de 30 s (2,9 kHz, 80 dB; intervalo entre intentos: 3 min; Med Associates Inc., St Albans, VT, EE. UU.). Se probó la expresión de la memoria del miedo en ratas en una cámara con diferentes señales visuales y de olor y se las expuso a tonos de señal de 6 × 30 s (consulte los métodos complementarios para obtener más detalles). La extinción se investigó repitiendo la prueba de expresión de miedo durante dos días más. La expresión de miedo se midió como % de tiempo dedicado a congelarse durante el tono de 30 s por dos experimentadores entrenados que desconocían la identidad del grupo de ratas en el momento de la puntuación. La expresión y extinción de la memoria del miedo se presenta como un promedio del bloque 1 (tonos 1 y 2) durante las sesiones de prueba de cada día, ya que la extinción puede observarse dentro de la sesión.

Los objetos se construyeron a medida y se hicieron interactivos (escalables) para aumentar el tiempo de exploración y la adquisición de memoria, ya que el reconocimiento de objetos novedosos se usa normalmente para estudiar la memoria a corto plazo [31] (Figura complementaria S3). A las ratas se les permitió 10 minutos para familiarizarse con dos copias del objeto A o del objeto B. Al día siguiente, se evaluó el reconocimiento de objetos nuevos durante 5 minutos reemplazando uno de los objetos familiares por uno nuevo. Los datos se presentan como un índice de reconocimiento, definido como: tiempo dedicado a explorar un objeto nuevo/(tiempo dedicado a explorar un objeto nuevo + familiar).

El comportamiento similar a la ansiedad basal se midió utilizando el paradigma del laberinto en cruz elevado (EPM) como se describió anteriormente [32, 33]. Los datos se representan como % de tiempo en brazo abierto, es decir, tiempo en brazo abierto/(tiempo en brazo abierto + tiempo pasado en brazo cerrado) *100.

La actividad locomotora se probó durante 30 minutos bajo niveles de luz ambiental (190–210 lux) en cámaras atenuadas de sonido (43 × 43 cm) equipadas con un sistema de detección de haz infrarrojo (Med Associates Inc.). Los datos se presentan como la distancia acumulada recorrida en intervalos de 5 min.

Los umbrales de sensibilidad a los golpes en los pies se probaron en cajas de Med Associates. Las ratas se expusieron a descargas en las patas durante 0,5 s en incrementos de 0,1 mA, a partir de 0,1 mA, y un observador ciego calificó la retracción de 1, 2 y 4 patas.

Las ratas recibieron infusiones bilaterales en el dmPFC (0,25 µl/infusión; velocidad: 0,1 µl/min; anteroposterior: +3 mm, mediolateral: ±0,6 mm, dorsoventral: −3,5 mm [34] de un virus adenoasociado (AAV) que contiene un ARN de horquilla corta dirigido a Prdm2 (AAV9.HI.shR.ratPrdm2.CMV.ZsGreen.SV40; GGAGCCCAAGTCCTTGTAAAT; título: 5.6E13 GC/mL; UPenn Core Facility, Philadelphia, PA) o un control codificado (AAV9.HI.shR. luc.CMV.ZsGreen.SV40; título: 9.2E13 GC/mL; UPenn Core Facility, PA).

Las ratas recibieron infusiones bilaterales en el dmPFC (0,25 µl/inyección; velocidad: 0,1 µl/min; coordenadas: anteroposterior: +3 mm, mediolateral: ±0,6 mm, dorsoventral: −3,5 mm [34] de un AAV que contenía un Cre-dependiente microARN dirigido a Prdm2 (AAV9.hSyn.DIO.-mcherry.miR.Prdm2.WPRE; GGAGCCCAAGTCCTTGTAAAT; título: 3.24E13 GC/ml; UPenn Core Facility, PA) o un control codificado (AAV9.HI.shR.luc.CMV. ZsGreen.SV40). Las ratas también recibieron infusiones bilaterales de un AAV que codifica Cre transportado retrógradamente (0,5 µl/infusión; velocidad: 0,1 µl/min; AAV-retro2-hSyn1-EGFP_iCre-WPRE-hGHp(A); título: 7,8 × 10E12 GC/mL; Addgene, Watertown, MA) en el BLA (anteroposterior: −2,4 mm, mediolateral: ±5 mm, dorsoventral: −8,4 mm [34]).

Las ratas recibieron infusiones bilaterales en el dmPFC de un vector AAV que contenía un shRNA dirigido a Prdm2 o un control codificado como se describe anteriormente. Las ratas también recibieron una infusión unilateral de un AAV que codifica GcaMP6s (0,5 µl/infusión; velocidad: 0,1 µl/min; AAV9.CaMKII.GcaMP6s.WPRE.SV40; título: 2,1E13 GC/mL; Addgene, Watertown, MA) en el BLA (anteroposterior: −2,4 mm, mediolateral: ±5 mm, dorsoventral: −8,4 mm). Después de las infusiones de vectores, se implantó una fibra óptica de borosilicato de 0,66 NA con núcleo de 400 µm unida a un receptáculo de titanio M3 (Doric Lenses, Quebec City, Canadá) dorsal a la BLA (anteroposterior: −2,4 mm, mediolateral: ±5 mm, dorsoventral: −8,5 mm). El receptáculo se aseguró al cráneo con una combinación de tornillos craneales, superpegamento y acrílico dental negro Ortho-Jet (Riss-Dental, Hanau, Alemania).

Se habituó a las ratas a estar conectadas a un latiguillo de fibra durante varios días antes de la sesión de acondicionamiento del miedo. La expresión clave de la memoria del miedo se evaluó nuevamente 24 h después del condicionamiento, y la fluorescencia emitida por GCaMP6s como indicador de la actividad del calcio se midió durante toda la sesión utilizando los métodos descritos previamente [35,36,37], con modificaciones menores. En resumen, los GCaMP6 se ​​excitaron a dos longitudes de onda (465 nm, señal dependiente de calcio y control isosbéstico de 405 nm) por la luz que se originaba en dos LED modulados sinusoidalmente (330 Hz y 210 Hz para 465 y 405 nm, respectivamente), reflejados en dicroico espejos (minicubo de fluorescencia de 4 puertos; lentes dóricas), y se acoplaron a un cable de conexión de fibra óptica de 400 μm 0.57NA que a su vez se conectó al implante de fibra. La intensidad de la luz para ambas longitudes de onda se ajustó a 10–15 µW en la punta del cable de conexión. Las señales emitidas por ambos canales regresaron a través de la misma fibra óptica y se adquirieron a 6,1 kHz utilizando un fotosensor integrado en el minicubo de fluorescencia, se demodularon (amplificación de bloqueo) y se digitalizaron a 1017,3 kHz, y se registraron mediante un procesador de señales en tiempo real ( RZ5D; Tucker Davis Technologies, Alachua, FL, EE. UU.). Las marcas de tiempo de comportamiento del inicio y el final del tono (CS+) se digitalizaron mediante la entrada TTL al procesador de señales en tiempo real de las cámaras de comportamiento de Med-Associates.

Para un análisis adicional fuera de línea, solo se incluyeron ratas con la colocación correcta de la fibra y la expresión de GcaMP directamente debajo de la punta de la fibra (inspección post-mortem), así como actividad de calcio observable (inspección visual de los rastros de toda la sesión). Este análisis se realizó utilizando una interfaz gráfica de usuario (GUI) personalizada basada en scripts de Python. Las señales sin procesar de 465 nm y 405 nm se muestrearon primero (50x) y se suavizaron (filtro de promedio móvil de fase cero con tamaño de ventana de 10 muestras). A continuación, se crearon histogramas peri-evento prueba por prueba con una ventana de tiempo que abarca -30 s y 40 s de inicio de tono circundante. Finalmente, se eliminó la tendencia de los datos para eliminar los artefactos de movimiento, fotoblanqueo y doblado de fibras. Por prueba, las señales de ambos canales se ajustaron de forma independiente a una curva de tiempo utilizando una regresión polinomial lineal para generar una señal predicha para ambos canales. La sustracción de la señal pronosticada de la señal sin procesar medida dio como resultado un ∆F para cada canal, que posteriormente se normalizó mediante la división por la señal pronosticada del canal, lo que resultó en ∆F/F. A continuación, las señales sin tendencia de los canales de 465 nm y 405 nm se restaron entre sí para calcular una señal fluorescente de GCaMP dependiente de calcio normalizada (% ∆F/F).

Para identificar los mecanismos moleculares aguas abajo de Prdm2 KD, específicamente en las neuronas que se proyectan desde el dmPFC al BLA, utilizamos el método vTRAP de purificación ribosomal de traducción viral. En este método, una construcción que codifica una subunidad ribosomal (L10a) etiquetada con proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) se expresa selectivamente en poblaciones neuronales de interés, usando, por ejemplo, el sistema Cre/lox. La subunidad etiquetada con EGFP luego se incorpora a los ribosomas de las células transfectadas. Estos ribosomas etiquetados, junto con el ARN de traducción unido a ellos, pueden aislarse con inmunoprecipitación y someterse a análisis de expresión génica utilizando RNAseq. La principal ventaja de usar TRAP es que el ARNm asociado con los ribosomas está en proceso de traducción. La traducción se produce después de que muchos de los eventos reguladores de la expresión génica ya hayan tenido lugar y, por lo tanto, la traducción del ARNm se correlacionará más estrechamente con los niveles de proteína [38].

Las ratas recibieron infusiones bilaterales en el dmPFC de un cóctel viral con 1:4 partes de un AAV9 que contenía un shRNA dirigido a Prdm2, o un control codificado, y 3:4 partes de un AAV5 que codifica una subunidad ribosomal etiquetada con EGFP dependiente de Cre ( EGFP-L10a; AAV5-FLEX-EGFPL10a; título: 7 × 10¹² vg/mL). Las ratas también recibieron infusiones bilaterales de Cre codificante de AAV2-retro (0,5 µl/infusión; AAV-retro/2-hSyn1-mCherry_iCre-WPRE-hGHp(A); título: 5,0 × 10E12 vg/mL) en el BLA (anteroposterior: −2,4 mm, mediolateral: ±5 mm, dorsoventral: −8,4 mm) [34]. El aislamiento de las neuronas que proyectan dmPFC-BLA se realizó como se describió anteriormente [39]. En resumen, se diseccionó dmPFC y las muestras se homogeneizaron en tampón de lisis (HEPES-KOH 10 mM; pH 7,4, KCl 150 mM, MgCl2 5 mM, DTT 0,5 mM, cicloheximida 100 mg/ml, RNasin; Promega y SUPERase-In™ , Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.; inhibidores de RNasa e inhibidores de proteasa sin EDTA completo, Roche, Basilea, Suiza). Las muestras se sometieron a tres pasos de centrifugación en los que se añadieron NP-40 al 10 % y DHPC 300 mM al sobrenadante después de la primera y la segunda centrifugación, respectivamente. La inmunoprecipitación de polisomas se realizó utilizando anticuerpos monoclonales anti-EGFP (Memorial Sloan-Kettering Monoclonal Antibody Facility; nombres de clones: Htz-GFP-19F7 y Htz-GFP-19C8) unidos a estreptavidina recubierta con proteína L biotinilada (Pierce; Thermo Fisher Scientific). -perlas magnéticas conjugadas (Life Technologies). Luego, el ARN se purificó utilizando el kit Absolutely RNA Nanoprep (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.). La concentración y la integridad del ARN se midieron con el ensayo Bioanalyzer RNA 6000 Pico (concentración de ARN: ∼990 pg/µl, RIN 9.5–10) y se enviaron a la Infraestructura Genómica Nacional (NGI, Suecia) para RNAseq.

Las muestras se secuenciaron en NovaSeq6000 (NovaSeq Control Software 1.7.0/RTA v3.4.4; Illumina, Inc., San Diego, CA, EE. UU.) con un 151nt(Read1)-10nt(Index1)-10nt(Index2)-151nt(Read2 ) configuración utilizando el flujo de trabajo 'NovaSeqXp' en la celda de flujo del modo "S4". La conversión de Bcl a FastQ se realizó utilizando bcl2fastq_v2.20.0.422 del paquete de software CASAVA. La escala de calidad utilizada es Illumina 1.8.

La calidad de los datos de secuenciación se evaluó mediante FastQC y Preseq. ¡El recorte de calidad y el recorte para eliminar secuencias de adaptadores se realizaron con TrimGalore! y Cutadapt en modo de recorte de extremos emparejados y con corte de puntuación Phred de calidad 20. Se usó el software alineador STAR para alinear las lecturas de secuenciación recortadas con el genoma de rata de referencia Ensembl Rnor_6.0 con datos de anotación asociados. La calidad de la alineación se evaluó con Qualimap y el mapeo de las lecturas alineadas con las características genómicas se realizó con featureCounts. Los resultados se resumieron utilizando MultiQC.

Los análisis posteriores se realizaron con el lenguaje de programación R y Rstudio. La normalización de la varianza y el tamaño de la biblioteca de los datos de conteo se realizó aplicando una transformación estabilizadora de la varianza (VST) antes del análisis de componentes principales. El análisis de expresión génica diferencial se realizó con el paquete R DESeq2. Se usó un valor p ajustado de tasa de descubrimiento falso por debajo de 0,05 como punto de corte para la significación estadística.

Utilizamos el software Ingenuity Pathway Analysis (IPA; Agilent Technologies) para identificar genes interconectados en una vía. La base de datos que respalda a IPA contiene más de 7 millones de hallazgos y se actualiza continuamente. El algoritmo utilizado por IPA nos permite identificar genes enriquecidos en una ruta determinada. También proporciona predicciones de activación/inhibición de vías, lo que indica si los cambios en la expresión génica identificados pueden conducir a la activación o inhibición de una vía específica. Para explorar más a fondo los patrones subyacentes de nuestros datos de RNA-seq, realizamos un análisis de red de coexpresión de genes ponderados (WGCNA), utilizando el paquete WGCNA R con parámetros predeterminados. A través de este enfoque, se construyó una red de coexpresión de genes ponderada basada en datos de conteo de lectura normalizados con VST. Se identificaron módulos de genes altamente coexpresados ​​e interconectados utilizando un tamaño de módulo mínimo de 30 genes, y se fusionaron módulos con perfiles de expresión similares (correlación > 0,75). El análisis de expresión diferencial se realizó ajustando un modelo lineal a los datos utilizando el paquete limma en R, comparando los perfiles de expresión de cada módulo entre Prdm2 KD y muestras de control codificadas. Los genes del módulo se analizaron para el enriquecimiento funcional en función de los datos de la base de conocimientos Gene Ontology, utilizando el paquete R clusterProfiler.

Después de completar los experimentos 3 y 6, se extrajeron los cerebros y se congelaron instantáneamente. Se recolectaron secciones de cerebro de 12 µm al nivel de dmPFC y se mantuvieron a -80 °C hasta su uso. La hibridación in situ se realizó siguiendo el manual de usuario del kit RNAscope Fluorescent Multiplex (Advanced Cell Diagnostics, Newark, CA) y como se describió anteriormente [23]. La sonda Prdm2 (número de acceso NM_001077648.1) se adquirió de Advanced Cell Diagnostics (Newark, CA, EE. UU.). Brevemente, las secciones se incubaron a 40 °C con una serie de 4 sondas diseñadas para amplificar las transcripciones hasta un punto en el que se puedan cuantificar individualmente. Esto incluye la sonda objetivo de Prdm2, una sonda preamplificadora, una sonda amplificadora y la sonda marcada con fluorescencia Atto 550 (roja) en el canal C1 para visualizar las transcripciones de Prdm2. Las microfotografías para la cuantificación se obtuvieron utilizando un microscopio confocal con un aumento de 20x (Zeiss LSM 700; Carl Zeiss AG, Jena, Alemania). Los niveles de ARNm de Prdm2 se evaluaron como píxeles totales de la señal fluorescente. Asumimos que cada píxel representa una sola molécula de ARNm. El total de píxeles positivos para Prdm2 se midió después de ajustar automáticamente el umbral utilizando el software ImageJ (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, EE. UU.) [40].

Los cerebros se extrajeron rápidamente y se colocaron en una solución de corte a base de N-metil-D-glucamina (NMDG) helada que contenía (en mM): 92 NMDG, 20 HEPES, 25 glucosa, 30 NaHCO3, 1,2 NaH2PO4, 2,5 KCl, 5 ascorbato de sodio, 3 piruvato de sodio, 2 tiourea, 10 MgSO4 y 0,5 CaCl2 (310 mOsm, pH 7,4). Se obtuvieron cortes cerebrales coronales agudos (250 μm de espesor) que contenían el PFC o el BLA utilizando un vibratomo (Leica VT1200 S, Leica Biosystems Inc., IL, EE. UU.). Después del corte, las rodajas se transfirieron a una cámara de mantenimiento llena con una solución de mantenimiento precalentada (∼34 °C) que contenía (en mM): 92 NaCl, 20 HEPES, 25 glucosa, 30 NaHCO3, 1,2 NaH2PO4, 2,5 KCl, 5 sodio ascorbato, 3 piruvato de sodio, 2 tiourea, 1 MgSO4 y 2 CaCl2 (310 mOsm, pH 7,4). Posteriormente, la solución de mantenimiento se mantuvo a temperatura ambiente y después de >1 h de recuperación, se transfirió un solo corte a la cámara de registro y se perfundió continuamente a una velocidad de flujo de ∼2,0 ml/min con solución calentada (∼30–32 °C). líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF, en mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 11 glucosa, 26 NaHCO3, 2,4 CaCl2 (310 mOsm, pH 7,4). Todas las soluciones se saturaron con 95 % de O2 y 5 % de CO2. Los EPSC espontáneos (sEPSC) se registraron utilizando pipetas de parche de vidrio de borosilicato (2,5–3,0 MΩ; Harvard Apparatus, MA, EE. UU.) que contenían (en mM): 135 K-gluconato, 20 KCl, 10 HEPES, 0,1 EGTA, 2 MgCl2, 2 Mg -ATP, 0,3 Na-GTP (290 mOsm, pH ajustado a 7,3 usando KOH). Los EPSC evocados (eEPSC) se registraron utilizando una solución intracelular basada en Cs que contenía (en mM): 140 Cs-metanosulfonato, 5 NaCl, 1 MgCl, 10 HEPES, 0,2 EGTA, 2 Mg-ATP, 0,5 Na-GTP, 5 QX- Cloruro 314 (290 mOsm, pH ajustado a 7,3 usando CsOH). La relación de pulsos emparejados se analizó como la relación entre eEPSC2 y eEPSC1 (0,05 Hz, intervalo entre pulsos de 50 ms, duración del estímulo de 50 μs). El cuadrado inverso del coeficiente de variación (1/CV2) se midió como la relación entre el cuadrado de la amplitud media y la varianza (μ2/σ2) de 20 eEPSC consecutivos (0,05 Hz). La relación entre la varianza y la media (VMR) se midió como la varianza dividida por la amplitud media (σ2/μ) de 20 eEPSC consecutivos (0,05 Hz). La relación AMPA/NMDA se midió dividiendo la amplitud máxima de la corriente mediada por AMPAR (medida a −70 mV) con el componente dependiente de NMDAR (medido a +40 mV, 50 ms después del inicio del eEPSC) en ausencia de bloqueadores de los receptores glutamatérgicos. Todas las grabaciones se llevaron a cabo en modo de sujeción de voltaje con un potencial de retención de -70 mV y en presencia de los bloqueadores de GABAR, picrotoxina (100 μM) y CGP55845 (2 μM). El potencial de unión estimado fue de 11 mV para K-Gluc y de 8,5 mV para la solución intracelular basada en Cs y no se compensó durante los registros electrofisiológicos. Los resultados se analizaron mediante pruebas de Mann-Whitney y todos los reactivos y fármacos se obtuvieron de Thermo Fisher Scientific.

Los datos de fotometría de fibra y de comportamiento se analizaron con Statistica 13.0 (TIBCO Software, Palo Alto, CA, EE. UU.) y los gráficos se generaron con Prism 9.1.2 (Graphpad Software LLC., San Diego, CA, EE. UU.). La normalidad se comprobó mediante la prueba de Shapiro-Wilk. Los datos de respuesta pico de calcio tuvieron que transformarse logarítmicamente para ajustarse a la distribución normal antes del análisis. La homogeneidad de la varianza se evaluó mediante la prueba de Levene. Los datos no violaron la suposición de homogeneidad y, por lo tanto, se analizaron mediante la prueba t de Student para datos no apareados, ANOVA de una vía o ANOVA de medidas repetidas de dos vías, según corresponda. El nivel de significación aceptado para todas las pruebas fue p < 0,05. Los datos se presentan como medias ± SEM, a menos que se indique lo contrario. El análisis de los datos de secuenciación de ARN y el registro electrofisiológico se describen anteriormente. El tamaño de la muestra para cada experimento se basó en la variación observada en experimentos anteriores similares y estudios piloto. Las ratas con inyección viral/fibra óptica que estaba fuera del área objetivo se eliminaron del estudio.

Para evaluar si Prdm2 KD afecta los procesos de memoria del miedo, las ratas recibieron microinfusiones bilaterales de un AAV que expresaba un shRNA dirigido a Prdm2 o un shRNA codificado en el dmPFC (Fig. 1A). Prdm2 KD dio como resultado una disminución de aproximadamente el 50% en la expresión de Prdm2 en el dmPFC (Fig. 1C, D; ANOVA unidireccional: F (1,17) <0.001, codificado: n = 9 y Prdm2 KD n = 10). Se probaron las ratas para la adquisición, expresión y extinción de la memoria del miedo 1 mes después de la infusión viral (Fig. 1E). Encontramos que Prdm2 KD en el dmPFC no afectó la adquisición de la memoria del miedo (Fig. 1F), pero aumentó significativamente la expresión de la memoria del miedo 24 h después de la sesión de acondicionamiento, según lo medido por una respuesta de congelación evocada por un tono mejorado (Fig. 2G, H; ANOVA de una vía: F(1,35) = 11.55; p = 0.002; codificado: n = 17 y Prdm2 KD n = 20).

Un escaneo de mosaico representativo del sitio de inyección de virus y la propagación. B, C Imágenes representativas utilizadas para la cuantificación de RNAscope. D KD de Prdm2 induce una regulación negativa significativa de Prdm2 en el dmPFC. E Cronología experimental: el día 1, las ratas recibieron una infusión bilateral de un AAV9 que contenía un shRNA-Prdm2 o un control codificado. Luego, las ratas se probaron para la adquisición del miedo (día 31), la expresión del miedo (día 32) y la extinción del miedo (día 33-34). F KD de Prdm2 no afectó la adquisición de la memoria del miedo (la adquisición de la memoria del miedo se presenta como un promedio de 2 a 6 tonos durante la sesión de condicionamiento), pero G aumentó significativamente la expresión del miedo 24 h después del condicionamiento (indicado por el % de congelación ± SEM; N = 17-20/grupo). H Promedio de los 2 primeros tonos de la prueba de expresión de miedo. I Prdm2 KD no afectó la tasa de extinción, indicado por la interacción para el tiempo x grupo que no es significativa (es decir, pendientes similares). J En un lote separado (N = 12/grupo), se descubrió que Prdm2 KD aumentaba la expresión de miedo también 1 semana después del acondicionamiento. K Cuando se eliminó Prdm2 1 semana después de la adquisición de la memoria del miedo (N = 18–20/grupo), no se observó ningún efecto sobre la expresión del miedo medida 1 mes después. *p < 0,05; ** p < 0,01; p < 0,001.

Prdm2 KD no afecta la sensibilidad al choque (A), la actividad locomotora (B), el reconocimiento de objetos nuevos (C) y la ansiedad basal (D).

A continuación, se evaluó la extinción de la memoria volviendo a exponer a los animales a la prueba de expresión, 48 h y 72 h después de la sesión de acondicionamiento. El ANOVA bidireccional de medidas repetidas mostró un efecto significativo del tiempo (F(2,70) = 64,2; P < 0,001), lo que indica una extinción robusta, y un efecto significativo del grupo en la respuesta de congelación provocada por la señal (Fig. 1I; F (1,70) = 9,64; p = 0,003). Sin embargo, las pendientes de las funciones de extinción fueron paralelas, reflejadas en una interacción tiempo × grupo no significativa (F(2,70) = 1,58; p = 0,21). Por lo tanto, la tasa de extinción no cambió con Prdm2 KD. Aunque la tasa de extinción no se vio afectada, también se observó una mayor expresión de miedo después de 3 días de sesiones de extinción de miedo en ratas con dmPFC Prdm2 KD en comparación con los controles codificados (F(1,35) = 4,10; P = 0,05). Esto sugiere un efecto persistente de Prdm2 KD en la expresión de la memoria del miedo. Luego probamos la expresión de la memoria del miedo en un momento posterior, 1 semana después de la adquisición, para evaluar el efecto a largo plazo de Prdm2 KD. Encontramos que Prdm2 KD aumentó significativamente el porcentaje de tiempo dedicado a la congelación también en este punto de tiempo (Fig. 1J; ANOVA unidireccional: F (1,22) = 5.11; p < 0.05; codificado: n = 12 y Prdm2 KD n = 12), lo que demuestra un efecto duradero de Prdm2 KD. En conjunto, estos datos establecen una regulación positiva de las respuestas de miedo condicionadas después de Prdm2 KD, con un curso de tiempo consistente con una reprogramación epigenética del transcriptoma.

Prdm2 KD aumentó específicamente la expresión del miedo sin influir en la adquisición del miedo (Fig. 1), lo que indica que PRDM2 no afecta los procesos de aprendizaje asociativo que vinculan el estímulo no condicionado (es decir, el impacto del pie) con el estímulo condicionado (es decir, el tono). Prdm2 KD puede mejorar la expresión del miedo al modular los procesos involucrados en la consolidación de la memoria o el recuerdo de la memoria. Para abordar esta pregunta, el AAV que contiene shRNA contra Prdm2 se infundió en el dmPFC una semana después del condicionamiento del miedo. Dado el tiempo necesario para que el shRNA reduzca de manera estable la expresión de Prdm2, la mayoría de los procesos de consolidación se habían formado en el dmPFC en ese momento [13, 41]. En estas condiciones, no observamos diferencias entre las ratas Prdm2 KD y los controles revueltos (Fig. 1K; revueltos: n = 20 y Prdm2 KD n = 18), lo que sugiere que Prdm2 KD en el dmPFC da como resultado un aumento persistente en la expresión de miedo a través de efectos en la consolidación de la memoria, en lugar de la recuperación de la memoria.

No observamos efectos de Prdm2 KD sobre la sensibilidad a los golpes del pie y la actividad locomotora, lo que sugiere un efecto específico de Prdm2 KD sobre la expresión del miedo (Fig. 2A, B; revuelto: n = 20 y Prdm2 KD n = 20). También probamos si Prdm2 KD afecta otros tipos de memoria, realizando una tarea de reconocimiento de objetos novedosos y no encontramos ningún efecto de Prdm2 KD en el índice de reconocimiento (Fig. 2C; codificado: n = 12 y Prdm2 KD n = 12). También se probó el efecto de Prdm2 KD en el comportamiento similar a la ansiedad. Observamos una tendencia a un porcentaje reducido de tiempo de brazo abierto en ratas Prdm2 KD. Sin embargo, esto no fue significativo, lo que sugiere que Prdm2 no afecta fuertemente los comportamientos innatos similares a la ansiedad (Fig. 2D; codificado: n = 20 y Prdm2 KD n = 20).

Las proyecciones de dmPFC -BLA participan en la mediación de la expresión del miedo [12, 13]. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que Prdm2 KD puede aumentar la expresión del miedo al modular la actividad de las neuronas que proyectan dmPFC-BLA. Para abordar esta hipótesis, primero investigamos si una KD selectiva de Prdm2 en las neuronas que proyectan dmPFC-BLA era suficiente para aumentar la expresión del miedo. Utilizamos un enfoque de vector dual, en el que se inyectó un AAV que codificaba Cre transportado retrógradamente en el BLA, y un microARN Prdm2 dependiente de Cre que codificaba un AAV se infundió en el dmPFC (Fig. 3A, B) [42]. De manera similar a lo que observamos con un Prdm2 KD en dmPFC que no era específico de la proyección, Prdm2 KD en dmPFC-BLA proyectando neuronas no afectó la adquisición del miedo condicionado (Fig. 3C) pero aumentó significativamente la expresión de la memoria del miedo 24 h después adquisición (Fig. 3D; ANOVA unidireccional: F(1,37) = 4,56; p < 0,05; codificado: n = 20 y Prdm2 KD n = 19). No se observaron diferencias en la actividad locomotora o el comportamiento similar a la ansiedad en los grupos Prdm2 KD dmPFC-BLA en comparación con los controles revueltos (Figura complementaria 4A. B, respectivamente). Se observó una tendencia a un porcentaje reducido de tiempo pasado en el brazo abierto en el grupo dmPFC-BLA Prdm2 KD, similar a la observada en el grupo dmPFC Prdm2 KD.

Un esquema que representa el enfoque viral dual. B Escaneos de mosaico que muestran la propagación viral en dmPFC y BLA e imágenes representativas que muestran neuronas dmPFC infectadas por AAV9-DIO-shRNA-PRDM2-ZS verde (verde), neuronas dmPFC infectadas por rAAV2 retro Cre-mCherry (rojo) y neuronas dmPFC que muestran coinfección de AAV9-DIO-shRNA-PRDM2-ZS green y rAAV2 retro Cre-mCherry (amarillo; barra de escala, 50 µm). C KD de Prdm2 en neuronas que se proyectan desde dmPFC a BLA no afectó la adquisición de miedo medida como % de congelación ± SEM. D Prdm2 KD en dmPFC-BLA fue suficiente para aumentar la expresión de miedo 24 h después del condicionamiento (N = 19–20). * p < 0,05. BLA amígdala basolateral, dmPFC corteza prefrontal dorsomedial.

Para identificar los objetivos moleculares aguas abajo a través de los cuales Prdm2 KD regula la consolidación de la memoria del miedo aumentada por dmPFC-BLA, secuenciamos el traductor de neuronas dmPFC-BLA utilizando una estrategia vTRAP (Fig. 4A, B; revuelto: n = 18 ratas; grupos de 3 dmPFC y Prdm2 KD n = 18 ratas; grupos de 3 dmPFC) [39].

Prdm2 KD en neuronas dmPFC-BLA regula genes implicados en la sinaptogénesis. Un esquema que representa el enfoque viral triple utilizado para el experimento vTRAP. B Escaneos de mosaicos que muestran la propagación viral en dmPFC y BLA, así como neuronas dmPFC que presentan células infectadas por AAV5-FLEX-EGFPL10a (verde), células infectadas por rAAV2 retro Cre-mCherry (rojo) y células que muestran coinfección de AAV5 -FLEX-EGFPL10a y rAAV2 retro Cre-mCherry (amarillo). C Análisis de componentes principales que muestra la separación de las muestras de Prdm2 KD y el control codificado en distintos grupos. D Volcano Plot que ilustra los genes alterados más significativamente después de Prdm2 KD. E Dendrograma de agrupamiento jerárquico que agrupa genes interconectados y altamente coexpresados. Los mapas de colores debajo del dendrograma corresponden a módulos de genes coexpresados. Mapa de colores superior: módulos identificados inicialmente. Mapa de colores inferior: módulos después de fusionar módulos con perfiles de expresión similares. F Análisis de expresión diferencial para cada módulo de coexpresión, comparando Prdm2 KD con control codificado. La línea discontinua horizontal roja indica un nivel de significación del valor de p corregido por FDR de 0,05. G Boxplot que compara el perfil de expresión génica del módulo "MEblue" entre condiciones. KD: Prdm2 KD, SCR: Control de codificación. Prueba estadística: Prueba t no pareada bilateral. H Gene ontology enriquecimiento para genes en el módulo "MEblue". I Análisis de red de genes realizado con IPA. Prdm2 KD aumenta la expresión de genes que codifican para la familia de receptores de cadherina, neurexina/neuroligina y efrina/efrina, así como para proteínas que pertenecen al complejo SNARE. J Expresión diferencial y nivel de significación para genes relacionados con la sinaptogénesis seleccionados. La línea discontinua vertical en el gráfico de barras indica un nivel de significación del valor de p corregido por FDR de 0,05. BLA amígdala basolateral, dmPFC corteza prefrontal dorsomedial.

Descubrimos que Prdm2 KD fue suficiente para alterar el perfil de traducción de las neuronas dmPFC-BLA (Fig. 4C, D). Usando vTRAP-RNAseq, secuenciamos 22 091 genes y encontramos que Prdm2 KD moduló la expresión de 3603 de estos (Tabla complementaria 1: 1877 regulado al alza y 1726 regulado a la baja). Como se esperaba, Prdm2 KD disminuyó la expresión de Prdm2 (Tabla complementaria 1: adj p = 3.33E-23) en las neuronas dmPFC-BLA. El análisis de WCNA identificó un total de 32 módulos de coexpresión de genes altamente correlacionados, que se fusionaron en 28 módulos distintos (Fig. 4E). Entre estos 28 módulos, el más grande llamado "MEblue" mostró una expresión diferencial significativa entre Prdm2 KD y el control codificado (Fig. 4F, G). Este módulo mostró un enriquecimiento de procesos biológicos como la organización de sinapsis y la regulación del potencial de membrana (Fig. 4H). También usamos IPA para agrupar genes en función de su función. Descubrimos que Prdm2 KD en las neuronas dmPFC-BLA moduló la expresión de genes que se han asociado con el condicionamiento del miedo, la ansiedad, el comportamiento emocional y la memoria (Tabla complementaria 2). De acuerdo con el análisis de WCNA, la principal red de genes significativa identificada por IPA incluía cambios en la expresión de genes asociados con la activación de la sinaptogénesis (Fig. 4I). Esta red constaba de genes que pertenecen a las familias de efrina, neuroligina y neurexina, así como genes asociados a SNARE (p. ej., sinaptotagminas, Fig. 4I, J). Se sabe que estas familias de genes contribuyen a la neurotransmisión y la formación de la memoria [43,44,45].

La reprogramación traduccional identificada por nuestro análisis RNAseq apuntó a la posibilidad de que Prdm2 KD module la consolidación del miedo condicionado al modificar la liberación de glutamato sináptico en los objetivos de proyección dmPFC -BLA. Para examinar esta posibilidad, llevamos a cabo experimentos de electrofisiología de corte. Primero evaluamos los efectos de dmPFC Prdm2 KD en las propiedades sinápticas basales de BLA midiendo las sEPSC, registradas de las neuronas principales putativas de BLA en controles codificados y ratas Prdm2 KD (Fig. 5A). Las ratas Prdm2 KD mostraron una mayor frecuencia de sEPSC en comparación con los controles codificados (Fig. 5B, C; codificados: 3,74 ± 0,45 Hz, n = 14; Prmd2 KD: 5,63 ± 0,70 Hz, n = 15; t (27) = 2,24, p < 0,05, prueba t no pareada). En cambio, las ratas Prdm2 KD no mostraron diferencias significativas en la amplitud (Fig. 5D; Scrambled: 10,45 ± 0,41 pA, n = 14; Prmd2 KD: 10,71 ± 0,61 pA, n = 15; t(27) = 0,35, p = 0,73; prueba t no pareada) y cinética (tiempo de subida: codificada: 2,16 ± 0,07 ms, n = 14; Prmd2 KD: 2,15 ± 0,06 ms, n = 15; t(27) = 0,08 p = 0,94, prueba t no pareada; Tiempo de caída: codificado: 10,93 ± 0,51 ms, n = 14; Prmd2 KD: 10,43 ± 0,31 ms, n = 15; t(27)=0,85 p = 0,40, prueba t no apareada; datos no mostrados) de sEPSC. Estos datos sugieren que Prdm2 KD en el dmPFC aumentó la liberación de glutamato en las neuronas principales de BLA.

Una imagen representativa que muestra la expresión viral (AAV9.HI.shR.ratPrdm2.CMV.ZsGreen.SV40) en terminales dmPFC dirigidas a BLA. B Rastros de sEPSC representativos registrados de neuronas principales putativas (PN) de BLA en ratas Scrambled o Prdm2 KD. Barras de escala: 50 pA × 500 ms. Distribuciones acumulativas y gráficos de barras que muestran la frecuencia (C) y la amplitud (D) de las sEPSC registradas a partir de supuestos BLA PN en ratas Scrambled o Prdm2 KD. E Representación esquemática de los sitios de electrodos de grabación y estimulación para grabaciones evocadas de (e)EPSC. F Trazas representativas de eEPSC evocadas por estimulaciones eléctricas emparejadas registradas de putativos BLA PN en ratas Scrambled o Prdm2 KD. Barras de escala: 50 pA × 25 ms. G Gráficos de barras que muestran los valores medios de PPR registrados a partir de PN BLA putativos en ratas Scrambled o Prdm2 KD. Gráficos de barras que muestran los valores medios de 1/CV2 (H) y VMR (I) de eEPSC registrados de ratas Scrambled o Prdm2 KD (N = 5–6/grupo). * p < 0,05. J Esquema que representa el enfoque de fotometría de fibra (arriba) y una imagen representativa (abajo) que muestra la fibra óptica implantada dirigida al BLA y la expresión de dos virus, AAV9.HI.shR.ratPrdm2.CMV.ZsGreen.SV40 en terminales dmPFC dirigidos el BLA así como AAV9.CaMKII.GCaMP6s.WPRE.SV40 en neuronas glutamatérgicas BLA. K Trazas que muestran una señal fluorescente GCaMP dependiente de calcio normalizada (media ± SEM) en neuronas BLA de ratas Scrambled o Prdm2 KD, promediadas sobre los primeros 2 tonos de la prueba de expresión de miedo. La duración del tono se indica mediante el cuadro gris sombreado. Gráficos de barras que muestran una señal GCaMP normalizada de pico más grande en respuesta al inicio del tono (L) y un área bajo la curva (AUC) aumentada de la señal GCaMP normalizada durante los 5 s que preceden al tono y los primeros 5 s de la presentación del tono (M) en Ratas Prdm2 KD comparadas con ratas de control Scrambled. Amígdala basolateral de BLA, amígdala central de CeA, corteza prefrontal dorsomedial de dmPFC, amígdala lateral de LA, relación entre la varianza de VMR y la media, corrientes postsinápticas excitatorias espontáneas de sEPSC.

Para investigar si Prdm2 KD afecta la probabilidad de liberación, comparamos la relación de pulso emparejado (PPR) de los eEPSC registrados eléctricamente a partir de neuronas principales BLA putativas de controles codificados y ratas Prdm2 KD (Fig. 5E, F). De acuerdo con una mayor probabilidad de liberación de las entradas glutamatérgicas de BLA, observamos una PPR más baja en ratas Prdm2 KD en comparación con los controles revueltos (Fig. 5G; Revueltos: 1,39 ± 0,13, n = 19; Prdm2 KD: 1,02 ± 0,07, n = 16 ; p < 0,05, prueba de Mann-Whitney). Además, para proporcionar una medida independiente de los cambios en la probabilidad de liberación, analizamos las alteraciones inducidas por Prdm2 KD en el cuadrado inverso del coeficiente de variación (1/CV2) y el VMR de eEPSCs [46]. Encontramos que las ratas Prdm2 KD exhiben un valor significativamente mayor de 1/CV2 (Fig. 5H; Scrambled: 18.14 ± 4.62, n = 19; Prmd2 KD: 36.46 ± 8.08, n = 16; p < 0.05, prueba de Mann Whitney), y un valor inferior casi significativo de VMR (Fig. 5I; Scrambled: 17,04 ± 3,90, n = 19; Prmd2 KD: 7,91 ± 1,69, n = 16; p = 0,08, prueba de Mann Whitney). Aunque no se pueden excluir los cambios simultáneos en el número de sitios de liberación de vesículas funcionales, estos datos parecen consistentes con los resultados de PPR, lo que sugiere además una mayor probabilidad de liberación de las entradas glutamatérgicas al BLA después de dmPFC Prdm2 KD. Por último, medimos la relación AMPA/NMDA para determinar si Prdm2 KD también podría alterar la expresión funcional relativa de los receptores glutamatérgicos BLA AMPA y NMDA. Prdm2 KD no logró alterar la relación AMPA/NMDA (Fig. 5 complementaria; Scrambled: 2,97 ± 0,60, n = 12; Prmd2 KD: 2,76 ± 0,33, n = 12; p = 0,86, prueba de Mann Whitney), lo que indica la ausencia de remodelación postsináptica en las sinapsis glutamatérgicas que convergen a la BLA en respuesta a Prdm2 KD.

Nuestros datos de comportamiento y electrofisiología sugirieron que Prdm2 KD puede estar potenciando la expresión del miedo condicionado con señales al aumentar la reactividad de las neuronas piramidales BLA a las señales asociadas al miedo. Para probar esta hipótesis, utilizamos fotometría de fibra para medir la actividad neuronal de BLA durante la expresión de la memoria del miedo (codificado: n = 9 y Prdm2 KD n = 13). Un vector AAV que codifica el sensor de calcio fluorescente GCaMP6s bajo el control del promotor CaMKII se inyectó unilateralmente en el BLA de ratas Prdm2 KD y controles codificados, seguido de la implantación de una fibra óptica (Fig. 5J). Las ratas se sometieron a una sesión de condicionamiento del miedo y se evaluaron 24 h más tarde para determinar la expresión de miedo condicionado inducida por señales, como antes, y se midió la actividad del calcio en el BLA durante la sesión de prueba. Confirmando nuestra hipótesis, se observaron cambios más grandes en la fluorescencia de GCaMP durante las dos primeras presentaciones del tono asociado con el miedo en ratas Prdm2 KD en comparación con los controles codificados (Fig. 5K). Este efecto se observó tanto al medir la señal GCaMP normalizada máxima en respuesta al inicio del tono (Fig. 5L; t(20) = 2,37, p = 0,03) como al calcular el área bajo la curva (AUC) de la señal GCaMP normalizada durante los 5 s que preceden al tono y los primeros 5 s de la presentación del tono (Fig. 5M; efecto del tratamiento: F(1,20) = 5,28; p = 0,03).

Divulgamos un papel mecánico de la enzima epigenética PRDM2 en la modulación de la consolidación de la memoria del miedo a través de la regulación de la vía neuronal dmPFC-BLA. Mostramos que la expresión mejorada del miedo después de Prdm2 KD puede resultar de una mayor expresión de genes involucrados en la liberación de neurotransmisores, lo que lleva a una mayor actividad de las neuronas glutamatérgicas dmPFC-BLA que proyectan durante el recuerdo de la memoria del miedo. Colectivamente, nuestros hallazgos proporcionan un nuevo mecanismo molecular a través del cual la proyección de dmPFC-BLA puede promover una respuesta de miedo excesiva y duradera.

Pruebas sustanciales respaldan el papel de los circuitos de la corteza prefrontal y la amígdala en la regulación del miedo y la ansiedad [12,13,14]. Los estudios de imágenes funcionales en humanos muestran una mayor conectividad funcional entre el dmPFC/corteza cingulada anterior (ACC) y la amígdala durante el procesamiento de amenazas en individuos sanos [47]. En individuos con trastornos de ansiedad generalizados o sociales, los pacientes con los síntomas más graves también muestran la mayor conectividad dmPFC/ACC-amígdala, lo que sugiere que este circuito no solo está involucrado en las respuestas adaptativas sino también desadaptativas al estrés [48]. En consonancia con el papel de la vía dmPFC/ACC-amígdala en las respuestas adaptativas al estrés, la investigación en animales muestra que la expresión del miedo depende de manera crítica de la activación de la vía dmPFC-BLA [11]. El miedo condicionado con señales fortalece las sinapsis excitatorias de dmPFC en el BLA [12], y el silenciamiento optogenético de las terminales de dmPFC en el BLA disminuye tanto la expresión del miedo como la evitación activa [13, 49].

Nuestros hallazgos son consistentes con estas observaciones y proporcionan un mecanismo molecular potencial de cómo pueden surgir las respuestas de miedo desadaptativas. Mostramos que Prdm2 KD en la vía dmPFC-BLA es suficiente para potenciar la expresión del miedo condicionado. También encontramos que Prdm2 KD induce cambios profundos en el perfil de traducción de las neuronas dmPFC-BLA y promueve una mayor neurotransmisión glutamatérgica en el BLA. Específicamente, Prdm2 KD modificó el perfil de traducción de 100 genes involucrados en la sinaptogénesis, lo que sugiere que PRDM2 juega un papel importante en la regulación de las funciones sinápticas. Prdm2 KD aumentó la expresión de genes que codifican el complejo SNARE (sinaptotagminas y sintaxinas) y los canales de calcio de tipo N. Además, Prdm2 KD aumentó la expresión de genes pertenecientes a familias de proteínas de adhesión celular (es decir, neurexinas, neuroliginas, efrinas) que se sabe que desempeñan un papel importante en la transmisión sináptica y la plasticidad sináptica [44, 45, 50]. Es importante señalar que en el enfoque vTRAP, solo se secuencian los ARNm que están asociados con los ribosomas (es decir, que están en proceso de traducción). Por lo tanto, los ARNm de traducción están más estrechamente relacionados con los niveles de proteína, lo que hace que los cambios en la traducción del ARNm después de Prdm2 KD tengan más probabilidades de afectar funcionalmente la actividad neuronal y, en consecuencia, temer los procesos de memoria. Nuestros hallazgos transatómicos indican claramente que Prdm2 KD facilita la liberación de neurotransmisores al aumentar la expresión de genes que controlan la fusión de vesículas sinápticas. Esta hipótesis está respaldada por nuestras grabaciones de abrazadera de parche que indican una mayor probabilidad de liberación de neurotransmisores en las entradas glutamatérgicas al BLA en ratas Prdm2 KD en comparación con los controles codificados. Además, las ratas Prdm2 KD mostraron una mayor actividad neuronal en el BLA durante la expresión del miedo, lo que sugiere que Prdm2 KD puede mejorar la expresión del miedo a través de una mayor eficacia sináptica de las neuronas que proyectan dmPFC-BLA.

Nuestros datos también indican que Prdm2 KD potencia la expresión del miedo al aumentar la consolidación de la memoria del miedo, un proceso a través del cual los recuerdos recién adquiridos se estabilizan para formar la memoria a largo plazo [51]. La fuerza de una consolidación de la memoria puede influir en la variación individual en las respuestas al miedo. Por ejemplo, la "consolidación excesiva" de un recuerdo asociado al trauma puede inducir una respuesta más fuerte y hacer que un individuo sea más propenso a desarrollar ansiedad patológica relacionada con el trauma [52, 53]. De acuerdo con el papel de Prdm2 en la consolidación de la memoria del miedo, se encontró que varios genes modulados por Prdm2 KD, incluido el factor neurotrófico derivado del cerebro y el gen de la proteína 1 de unión a elementos sensibles al AMP cíclico, están asociados con la consolidación de la memoria del miedo [54 ,55,56,57]. Además, un estudio reciente de Chen et al. [58] demostraron que la consolidación de la memoria del miedo se asocia con una mayor expresión de genes que codifican proteínas del complejo SNARE y varias neuroliginas y neurexinas. En lo que podría compararse con un mecanismo de preparación, el aumento de la expresión de estos genes antes de la exposición al miedo puede contribuir a la posterior consolidación excesiva de los recuerdos del miedo. Debido a que la exposición prolongada del cerebro al alcohol regula a la baja la expresión de Prdm2 en el dmPFC [23], nuestros hallazgos también proporcionan un mecanismo candidato para una mayor vulnerabilidad a la sobreconsolidación patológica de los recuerdos del miedo en personas con trastornos por consumo de alcohol, en consonancia con la alta co -morbilidad por consumo excesivo de alcohol y TEPT [59].

En conclusión, proponemos un mecanismo novedoso para una mayor consolidación de la memoria del miedo, en el que la disminución de la expresión de Prdm2 en las neuronas que proyectan dmPFC-BLA da como resultado cambios translatómicos que promueven una mayor eficacia sináptica en el BLA y un aumento de las respuestas neuronales de dmPFC-BLA a las señales asociadas al estrés. Este estudio también proporciona el primer conjunto de pruebas del papel de PRDM2 en los trastornos relacionados con el estrés. Finalmente, dados nuestros hallazgos previos de que la dependencia del alcohol regula a la baja la expresión de dmPFC PRDM2 [23], proporcionamos un mecanismo candidato para la comorbilidad extensa del consumo de alcohol y los trastornos de ansiedad.

Se ha publicado una corrección de este artículo: https://doi.org/10.1038/s41380-022-01827-w

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Damos las gracias al Dr. K. Meletis por su ayuda con respecto al experimento vTRAP. Agradecemos al Dr. V. Loitto y al Core Facility—Unidad de Microscopía de la Facultad de Medicina de la Universidad de Linköping por su asistencia técnica. Agradecemos a la instalación central de NGI Estocolmo - SciLifeLab por realizar la preparación de la biblioteca y la secuenciación del ARN. Este trabajo fue financiado por el Consejo Sueco de Investigación (Subvención No. 2013–07434), la Región Östergotland, Stiftelsen Psykiatriska Forskningsfonden, la Fundación Wallenberg y la Beca Knut och Alice Wallenberg Stiftelse. CC es miembro de Wallenberg Molecular Medicine y recibe un generoso apoyo financiero de la Fundación Knut y Alice Wallenberg. Los autores no informan intereses financieros biomédicos ni posibles conflictos de intereses.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Universidad de Linköping.

Estos autores contribuyeron igualmente: Riccardo Barchiesi, Kanat Chanthongdee.

Centro de Neurociencia Social y Afectiva, Departamento de Ciencias Biomédicas y Clínicas, Universidad de Linköping, S-581 85, Linköping, Suecia

Riccardo Barchiesi, Kanat Chanthongdee, Michele Petrella, Li Xu, Esi Domi, Gaelle Augier, Andrea Coppola, Joost Wiskerke, Ilona Szczot, Eric Augier, Markus Heilig y Estelle Barbier

Departamento de Fisiología, Facultad de Medicina Hospital Siriraj, Universidad Mahidol, Bangkok, Tailandia

Kanat Chanthongdee

Centro Wallenberg de Medicina Molecular, Universidad de Linköping, Linköping, Suecia

Simon Söderholm y Claudio Cantu

Departamento de Ciencias Biomédicas y Clínicas, División de Medicina Molecular y Virología; Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Linköping, Linköping, Suecia

Simon Söderholm y Claudio Cantu

Unidad de Biología de la Adicción, Departamento de Psiquiatría y Neuroquímica, Instituto de Neurociencia y Fisiología, Academia Sahlgrenska, Universidad de Gotemburgo, Gotemburgo, Suecia

Ana Domi y Louise Adermark

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EB y MH conceptualizado y diseñado los estudios. EB diseñó y supervisó experimentos, analizó e interpretó los resultados. RB, KC, EB, EA y GA realizaron los experimentos de comportamiento. RB, KC, CA y EB realizaron el análisis molecular. EB, ED, RB, LX y MP realizaron cirugías. MP, AD, LA realizaron registros y análisis electrofisiológicos. SS y CC realizaron el análisis bioinformático de los datos de secuenciación de ARN. JW e IS analizaron los datos de fotometría de fibra. EB, RB y MH redactó el manuscrito. Todos los autores han leido y aprobado el manuscrito.

Correspondencia a Estelle Barbier.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

La versión original en línea de este artículo fue revisada: En la versión original de este artículo, los nombres y apellidos de Riccardo Barchiesi, Kanat Chanthongdee, Michele Petrella, Li Xu, Simon Söderholm, Esi Domi, Gaelle Augier, Andrea Coppola, Joost Wiskerke , Ilona Szczot, Ana Domi, Louise Adermark, Eric Augier, Claudio Cantù, Markus Heilig, Estelle Barbier estaban mal estructurados. Los nombres se mostraban correctamente en todas las versiones en el momento de la publicación. El artículo original ha sido corregido.

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Reimpresiones y permisos

Barchiesi, R., Chanthongdee, K., Petrella, M. et al. Un mecanismo epigenético para la sobreconsolidación de los recuerdos del miedo. Mol Psychiatry 27, 4893–4904 (2022). https://doi.org/10.1038/s41380-022-01758-6

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Recibido: 17 diciembre 2021

Revisado: 09 agosto 2022

Aceptado: 18 de agosto de 2022

Publicado: 21 de septiembre de 2022

Fecha de emisión: diciembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41380-022-01758-6

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