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Dec 29, 2023

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 7241 (2022) Citar este artículo

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El miófago ϕKp24 de Klebsiella jumbo muestra una disposición inusualmente compleja de fibras de la cola que interactúan con una célula huésped. En este estudio, combinamos métodos de microscopía crioelectrónica, métodos de predicción de estructuras de proteínas, simulaciones moleculares, enfoques microbiológicos y de aprendizaje automático para explorar la cápside, la cola y las fibras de la cola de ϕKp24. Determinamos la estructura de la cápside y la cola a una resolución de 4,1 Å y 3,0 Å. Observamos que las fibras de la cola se ramifican y se reorganizan dramáticamente al unirse a la superficie celular. Esta configuración compleja involucra catorce fibras de cola putativas con actividad despolimerasa que proporcionan a ϕKp24 con la capacidad de infectar un amplio panel de tipos de polisacáridos capsulares (CPS) de Klebsiella pneumoniae. Nuestro estudio proporciona información estructural y funcional sobre cómo ϕKp24 se adapta a las superficies variables de patógenos bacterianos encapsulados, lo que es útil para el desarrollo de enfoques de terapia con fagos contra cepas de K. pneumoniae resistentes a panfármacos.

Las bacterias que causan enfermedades representan una amenaza cada vez mayor para la salud humana. Si bien muchas infecciones bacterianas pueden curarse de manera efectiva con antibióticos, la resistencia a los antimicrobianos (AMR, por sus siglas en inglés) resulta cada vez más en tratamientos ineficaces. Un estudio reciente informó de 3,57 millones de muertes asociadas con RAM en seis patógenos principales en 20191. Entre ellos se encuentra Klebsiella pneumoniae, un patógeno reconocido por la Organización Mundial de la Salud como prioridad 1 (crítica) para el desarrollo de nuevos antibióticos2. K. pneumoniae puede causar neumonía, infección del tracto urinario, bacteriemia y otras enfermedades infecciosas en humanos, especialmente en personas con inmunidad comprometida3. La gran mayoría de los aislamientos clínicos de K. pneumoniae expresan una cápsula pronunciada que generalmente se considera un factor de virulencia importante que media la protección del sistema inmunitario del huésped4. Hay más de cien tipos de locus capsulares genéticamente distintos, de los cuales 77 estructuras químicas bien caracterizadas se utilizan en la serotipificación (tipos K)5.

Aunque la K. pneumoniae multirresistente es insensible a los antibióticos estándar, sigue siendo susceptible a la infección por bacteriófagos. Los bacteriófagos, o fagos para abreviar, son virus que infectan bacterias. Los fagos específicos de Klebsiella pueden infectar y matar con éxito a su huésped natural; sin embargo, la mayoría de estos fagos suelen ser altamente específicos de cepa debido a los polisacáridos capsulares variables (CPS) de esta especie, que actúan como un receptor primario de fagos. Los fagos de Klebsiella dependientes de la cápsula, incluidos los fagos ΦK64-1 o vB_KleM-RaK26,7, están equipados con fibras de cola o puntas de cola que sirven como proteínas de unión al receptor (RBP) que contienen dominios enzimáticos degradantes de CPS (despolimerasas de cápsula acuñadas) que permiten la adsorción exitosa de fagos e infección8. Para simplificar, de ahora en adelante usaremos el término "fibra de la cola".

Los bacteriófagos con cola con genomas de >200 kpb de ADN se definen como fagos jumbo9. Las características estructurales más notables de los fagos jumbo son grandes cápsides que encapsulan su genoma10. El miófago jumbo vB_KpM_FBKp24 (ϕKp24) descrito recientemente codifica al menos nueve fibras de la cola que contienen diferentes dominios de despolimerasa, lo que sugiere una gama de huéspedes ampliada. El análisis genómico reveló que ϕKp24 tiene una similitud muy limitada con cualquier otro fago11 conocido y, por lo tanto, constituye una nueva familia denominada Vanleeuwenhoekviridae (clasificación ICTV en curso). Además, la microscopía electrónica de transmisión reveló una estructura compleja única de fibras de cola en la placa base. Sin embargo, actualmente falta una visión más detallada de la estructura y la función de este conjunto único de fibras de la cola.

Para obtener información sobre la estructura inusual de ϕKp24, analizamos su cápside, cola y fibras de cola utilizando diferentes métodos estructurales. Generamos modelos atómicos para la cápside y la cola del fago altamente ordenados mediante el análisis de una sola partícula (SPA) de criomicroscopía electrónica (cryo-EM) combinado con predicciones de la estructura de la proteína AlphaFold212 y simulaciones de dinámica molecular (MD). Los datos revelaron características inusuales de la cápside de ϕKp24, sobre todo la composición de toda la cápside por un solo MCP y la presencia de un poro en el centro de los hexágonos. Obtuvimos información sobre la estructura de las fibras de la cola flexibles y desordenadas mediante tomografía crioelectrónica (crio-ET). Este análisis fue ayudado por enfoques de aprendizaje automático para entrenar una red neuronal para rastrear automáticamente las fibras complejas de la cola para el análisis cuantitativo de los datos de tomografía. Nuestro análisis reveló una reorganización pronunciada de las fibras de la cola durante el proceso de infección. Además, probamos la infectividad de ϕKp24 usando una colección de serotipos K de cepas de K. pneumoniae, mostrando el panel inusualmente amplio de tipos de CPS a los que se dirigen las fibras de la cola.

La predicción de la secuencia de aminoácidos y los ensayos de unión frente a una biblioteca de serotipos de Klebsiella en combinación con un análisis de estructura y función de las fibras de la cola proporcionaron información sobre su organización compleja hiperramificada. La combinación de técnicas estructurales, computacionales y de laboratorio nos permitió obtener una visión profunda de la estructura y función de este bacteriófago distinto.

Para estudiar la estructura de la cápside ϕKp24, tomamos imágenes del fago usando crio-EM (Fig. 1a complementaria, parámetros de recopilación de datos en la Tabla complementaria 1). En nuestro conjunto de datos, encontramos tres variantes de la cápside: cápsides llenas llenas de ADN, cápsides vacías y cápsides parcialmente llenas de ADN. Reconstruimos las estructuras de la cápside completa (EMD-14356, figura complementaria 1b, cian) y vacía (EMD-13862, figura 1a) de ϕKp24 con Relion13 a una resolución de 4,3 Å y 4,1 Å después del pulido y la corrección de la esfera de Ewald, respectivamente. utilizando el criterio FSC0.143 "estándar de oro"14 (Figura complementaria 2b, c). Dado que las reconstrucciones de cápside vacía y llena se superponen bien (Fig. 1d complementaria), centramos nuestro análisis en la reconstrucción de mayor resolución de la cápside vacía (4.1 Å). La cápside vacía (Fig. 1a) tiene un diámetro de 145 nm de vértice a vértice, 130 nm a lo largo del doble eje de simetría, y sigue una T = 27 (h = 3; k = 3; T = h2 + k2 + hk) simetría de triangulación con contorno plano. (Figura 1b).

a La cápside vacía de dsDNA (EMD-13862) del fago ϕKp24 se reconstruyó con una resolución de 4,1 Å usando 19 193 partículas. La estructura mostrada está coloreada radialmente según la distancia desde el centro de la cápside usando la barra de color en la parte inferior derecha. b Esquema que ilustra la organización de la cápside ϕKp24. La cápside sigue una simetría T = 27. Los volúmenes h y k en el cálculo de simetría de triangulación están resaltados en rojo (https://viralzone.expasy.org/8577). c Organización de un hexámero. Un hexámero puede interactuar con otros hexámeros o un pentámero a través de brazos (azul) o manos (naranja) que probablemente tengan una función estabilizadora similar a las proteínas decorativas presentes en otras estructuras de fagos. d Diagrama de cinta de gp372 del fago ϕKp24 generado por AlphaFold2. El modelo consta de tres partes coloreadas correspondientes al monómero de un hexámero en c. El panel derecho muestra gp372 ajustado en el mapa de densidad. e Vista superior de un capsómero hexamérico. Los seis monómeros están coloreados individualmente. En el centro del hexámero, un poro está formado por seis bucles C-terminales largos que se entrelazan (recuadro rectangular ampliado, panel superior derecho). El panel inferior derecho muestra el poro después de la rotación de la imagen superior en 90°. f Dos hexámeros con interacciones resaltadas entre capsómeros. Dos regiones de mano gp372 interactúan entre sí a través de un gran grupo de residuos cargados, incluidos E201, K210, K247, D249, E251, D260 y R264 (cuadro rectangular ampliado, panel superior). Los cuerpos triangulares MCP dentro del mismo hexámero interactúan mediante puentes salinos complementarios entre el residuo R477 y E442 del vecino en el sentido de las agujas del reloj, y el residuo R583 y D419 y D587 del vecino en el sentido de las agujas del reloj (recuadro rectangular ampliado, panel inferior izquierdo). El cuerpo triangular también interactúa con la región de la mano a través de una serie de puentes de sal, incluidos K380/E220, E398/R190, R554/E313 y R558/D163 (cuadro rectangular ampliado, panel inferior derecho). Los enlaces de hidrógeno se analizaron utilizando ChimeraX con criterios de distancia y ángulo relajados (0,4 Å y 20 ° de tolerancia, respectivamente). g Vista lateral de las interacciones hexámero-hexámero después de la rotación de la imagen superior en 90°.

La cápside del fago phiKZ15 de Pseudomonas aeruginosa Jumbo y los fagos ϕRSL116 y ϕRSL217 de Ralstonia solanacearum se construyen en el pliegue HK9718,19 con un número de triangulación de T = 27. Similar a estas cápsides de fago, la cápside de ϕKp24 se construye una red de hexámeros y pentámeros en cada faceta (Fig. 1b). Los hexámeros y pentámeros de ϕKp24 están formados por copias de la misma proteína principal de la cápside (MCP, gp372, número de acceso QQV92002). La cápside contiene un total de 260 hexámeros (verde oscuro, 13 por faceta) y 11 pentámeros (turquesa, un vértice está ocupado por el complejo del portal), que representan 1615 copias del MCP (Película complementaria 1). Las MCP se ensamblan en una capa icosaédrica que encierra el genoma del fago. En el caso de ϕKp24, el MCP predicho es gp372 (Fig. 1d, izquierda).

Gp372 contiene 597 aminoácidos y, según nuestro conocimiento, es la MCP más grande descrita actualmente en cualquier fago. Su estructura se predijo y modeló utilizando AlphaFold212 (Fig. 1d, izquierda). Consta de tres partes principales: un "cuerpo triangular" (Fig. 1c, triángulo gris y Fig. 1d, cuadro punteado, residuos 28–88, 314–597); un "brazo" (Fig. 1c, óvalo azul y Fig. 1d, azul, residuos 89-166); y una "mano" (Fig. 1c, óvalo naranja y Fig. 1d, naranja, residuos 167–313).

Mientras que el cuerpo triangular de MCP gp372 no muestra similitud a nivel de secuencia con la MCP gp5 del fago HK9720,21, exhiben cierta similitud estructural. Sin embargo, existen algunas diferencias notables entre el MCP de ϕKp24 y HK97. Gp372 de ϕKp24 contiene un bucle C-terminal largo (un componente del poro) que está ausente en HK97. Además, los dominios N-terminal y C-terminal se pliegan de manera diferente: (1) el dominio A del monómero HK97 gp5 tiene cuatro láminas β centrales, en su mayoría antiparalelas, y dos hélices20. Por el contrario, hay cinco hojas β antiparalelas y cuatro hélices de diferentes longitudes en el dominio correspondiente de gp372 (dominio C-terminal); (2) el brazo N-terminal del monómero HK97 gp5 tiene una conformación mayormente no estructurada, mientras que el N-terminal de gp372 se pliega como una hélice larga (Figs. 5, 6 complementarias). El brazo consta de dos hojas β antiparalelas cortas, tres hélices cortas y una hoja β corta cerca de la "mano". La característica más destacada de la mano son dos capas de hojas β, y cada capa contiene tres hojas β antiparalelas. Además, hay dos hélices cortas en la punta de la "mano".

Para refinar aún más la estructura gp372 de acuerdo con nuestros datos crio-EM 3D y para determinar las supuestas interacciones entre las MCP en el ensamblaje nativo de la cápside, luego reconstruimos modelos de los ensamblajes de hexámero y pentámero de la cápside, incluidos los hexámeros vecinos más cercanos (Fig. 9 complementaria) como se describe en detalle en la sección Métodos. Brevemente, los modelos de los ensamblajes de hexámero y pentámero se construyeron primero a través del acoplamiento rígido de la estructura gp372 predicha y luego se refinaron a nuestro mapa de 4.1 Å usando ajuste flexible de dinámica molecular (MDFF)22. Luego, el modelo de hexámero resultante se acopló de forma rígida a las regiones correspondientes que rodean los ensamblajes refinados de pentámero y hexámero, y las estructuras combinadas se sometieron a una simulación MDFF adicional. Por lo tanto, los modelos obtenidos brindan información representativa sobre cada interacción MCP-MCP única dentro de la cápside, lo que permite una evaluación de las interacciones clave de residuos-residuos que probablemente sean cruciales para la estabilidad de la cápside.

Después de analizar los contactos entre MCP del hexámero, reunimos una lista de supuestas interacciones fuertes (Fig. 9 complementaria). El cuerpo triangular de las MCP interactúa principalmente con los cuerpos triangulares de las MCP directamente adyacentes y dentro del mismo hexámero (Fig. 1f). Estas interacciones incluyen una serie de puentes salinos complementarios entre el residuo R477 y E442 en el vecino en el sentido de las agujas del reloj, así como el residuo R583 y D419 y D587 en el vecino en el sentido de las agujas del reloj. El cuerpo triangular también interactúa fuertemente con la región de la mano de su vecino en el sentido de las agujas del reloj a través de una serie de puentes de sal (Fig. 1f), incluidos K380/E220, E398/R190, R554/E313 y R558/D163. Además de estas interacciones formadas entre MCP dentro del mismo hexámero, la región de la mano también media interacciones fuertes con la región de la mano de una MCP de un hexámero adyacente (Fig. 1f). Estos involucran un gran grupo de residuos cargados, incluidos E201, K210, K247, D249, E251, D260 y R264, que forman interacciones complementarias. Las conformaciones generales de los hexámeros centrales y circundantes son bastante similares y muestran un desplazamiento cuadrático medio (RMSD) de la columna vertebral de ~ 1,5 Å. Finalmente, en comparación con otras estructuras conocidas de la cápside del fago23,24, la MCP de ϕKp24 mostró una característica estructural que, hasta donde sabemos, no se había informado previamente: cada uno de los seis bucles C-terminales largos (residuos Q582-S597) participa en el formación de un poro helicoidal central con un diámetro exterior de ~ 2 nm (Fig. 1e, paneles superior e inferior derechos). El análisis de la electrostática a lo largo del poro (Fig. 10 complementaria) muestra que cerca de la entrada (desde el exterior hacia la cápside interna) es hidrofílico, mientras que desde el lado opuesto es lipofílico. Además, cerca del centro del poro, contiene una sección anular que está cargada negativamente.

Cada pentámero consta de cinco monómeros MCP (Fig. 2a). En comparación con una gp372 en un hexámero, el terminal N en la gp372 del pentámero muestra una dirección de plegado diferente (Fig. 2b, panel izquierdo). Además, gp372 en un pentámero cambia la orientación relativa del cuerpo triangular y la mano en comparación con el MCP en un hexágono, lo que hace que gp372 sea más curvo en un pentámero. (Fig. 2b, panel derecho). La comparación de los hexámeros que rodean al pentámero con los del ensamblaje hexamétrico muestra que también están ligeramente más curvados y muestran un RMSD de 3 a 5 Å.

una vista superior de un capsómero pentamérico. Se ajustaron cinco estructuras gp372 en el mapa de densidad y se colorearon de forma diferente. Comparado con el hexámero, el pentámero carece de un poro estructurado en el centro. Cada bucle C-terminal es flexible y tiende a moverse al área más cercana a la mano de otro gp372. b Comparación estructural entre MCP (cian) en un hexámero y MCP (gris) en un pentámero. Hay algunas diferencias, como el bucle C-terminal, la hélice α N-terminal y el ángulo de péndulo (flecha roja superior) de dos cuerpos triangulares (mano y brazo alineados), o el ángulo de péndulo (flecha roja inferior) de dos manos (cuerpo triangular alineado). La imagen de la derecha en b muestra la comparación después de la rotación de la estructura izquierda en 90°. c Interacciones pentámero-hexámero. Las interacciones entre un pentámero (gris) y un hexámero vecino (cian) son similares a las interacciones entre dos hexámeros. El panel superior izquierdo muestra que la mano (gris) del vecino en el sentido de las agujas del reloj (CW) puede interactuar con el cuerpo triangular (púrpura) en el mismo pentámero usando puentes salinos (residuos E220 y K380, E163 y R558). En el pentámero MCP, los residuos R501 y R583 en el cuerpo triangular interactúan con los residuos D448 y E442 (el cuadro rectangular ampliado, panel superior derecho). La gp372 de un hexámero y la gp372 de un pentámero se destacan con diferentes colores según las unidades estructurales. El cuerpo triangular, el brazo y la mano del gp372 en hexámero son de color negro, azul intenso y naranja. El cuerpo triangular, el brazo y la mano del gp372 en pentámero son de color púrpura, verde y rosa. d Vista lateral de las interacciones pentámero-hexámero después de la rotación de la imagen superior en 90°.

En general, las regiones de interacción de MCP en un pentámero son similares a las que se ven en el hexámero (Fig. 1f, Fig. 9 complementaria). Sin embargo, el aumento de la curvatura del pentámero (Figs. 1g, 2d) altera la orientación relativa entre el cuerpo triangular y las regiones de la mano, lo que lleva a contactos estabilizadores diferenciales. Específicamente, en el pentámero MCP, los residuos R501 y R583 en el cuerpo triangular interactúan con los residuos D448 y E442, respectivamente, en el cuerpo triangular del vecino en el sentido de las agujas del reloj. Las interacciones con la región de la mano en el sentido de las agujas del reloj se reducen en general, lo que implica que los residuos K380 y R558 interactúen con los residuos E220 y D163, respectivamente. Además, como se ve en el hexámero MCP, la región de la mano en el pentámero MCP juega un papel análogo en la mediación de las interacciones mano-mano con un hexámero vecino a través de un parche cargado de residuos descrito anteriormente. En contraste con la disposición del hexámero, los bucles C-terminales en el pentámero no parecen formar un poro grande y bien definido en el mapa de densidad. En cambio, están desordenados, quizás debido a esta disposición diferente al espacio reducido y al mayor impedimento estérico entre las MCP en esta región (Fig. 2a). Sin embargo, observamos una pequeña abertura en el centro del pentámero que puede ser capaz de transportar solventes.

Para la reconstrucción helicoidal de la cola, se seleccionaron segmentos de 450 píxeles de fagos que contenían cápsides completas. Después de la clasificación, el pulido y el refinamiento 3D, se determinó la estructura de la cola (EMD-14357, Fig. 3a) en su conformación extendida a una resolución de 3,0 Å en Relion13 (Fig. 11b complementaria). La longitud de la cola extendida es de 180 nm en promedio (medida en micrografías 2D, desde el collar hasta la punta de la espiga). Según el mapa de densidad, el diámetro de la cola es de 24,5 nm y la longitud del monómero de la vaina en el eje más largo es de 11 nm (Fig. 3a). Al igual que otros sistemas de eyección contráctiles descritos y colas de bacteriófagos, la vaina de la cola contráctil de ϕKp24 se ensambla alrededor del tubo interior. La funda y el tubo interior siguen la misma simetría helicoidal con una simetría adicional de 6 veces alrededor del eje de la cola. El grosor de un anillo hexamérico es de 4 nm. Utilizando HI3D25, la elevación helicoidal y la torsión se determinan en 39,03 Å y 20,89°, respectivamente.

a Orientaciones de vista superior (imagen superior) y vista lateral (imagen inferior) de la estructura 3D (EMD-14357) de la cola helicoidal de 3,0 Å. Cada una de las seis hebras helicoidales tiene un color diferente. b Modelo de proteína gp118 de la vaina de la cola generada a partir de Alphafold2. La proteína de vaina gp118 y la proteína del tubo interno gp119 se ajustaron en un anillo del mapa EM ϕKp24 (imagen superior, vista superior; imagen inferior, vista lateral). En el panel inferior, se muestra el monómero de la vaina (azul) que se origina en la capa inferior para permitir la visualización de las interacciones anillo-anillo. Los contactos entre tres monómeros de vaina se resaltan a partir de dos anillos sucesivos (el cuadro rectangular ampliado, panel inferior derecho). c Diagrama de cinta del modelo AlphaFold2 predicho del monómero de vaina ϕKp24, gp118. El modelo consta de dos partes: la vaina central (cuadro punteado, naranja y azul oscuro) y un componente de vaina exterior extendida (azul claro). La imagen inferior se gira con respecto a la imagen superior 90° para mostrar la extensión del terminal N. d Esquema de la organización de la funda ϕKp24. La cresta, donde interactúan los tres monómeros de la vaina de dos capas, se muestra en un círculo.

La estructura de la proteína de la vaina (gp118, n.º de acceso QQV92013.1) se predijo usando AlphaFold2 y se ajustó al mapa EM de la cola ϕKp24 usando ISOLDE26 en ChimeraX27 (Fig. 3b). La proteína de vaina de longitud completa se compone de componentes de vaina exterior y central. El componente de la vaina exterior (Fig. 3c, azul claro) está ubicado en la punta del monómero de la vaina, apuntando hacia afuera. El análisis de secuencia por ENDscript328 muestra que el componente de la vaina exterior es un homólogo de la proteína gp29PR de la vaina de la cola (PDB ID: 3SPE) del bacteriófago phiKZ (Fig. 15 complementaria). Este componente de la vaina exterior no está involucrado en las interacciones entre las subunidades durante el ensamblaje29. En la conformación contraída, los componentes de la vaina exterior de dos capas pueden interactuar entre sí a través de fuerzas electrostáticas. Esto es probable ya que las superficies que miran hacia arriba de los componentes de la vaina exterior contienen un parche con carga negativa, mientras que las superficies que miran hacia abajo muestran un parche con carga positiva (Fig. 18 complementaria).

El componente de la vaina central (Fig. 3c, naranja y azul oscuro) consta del dominio C-terminal, el dominio N-terminal y dos extensiones largas. La vaina central es fundamental en el montaje y contracción de la vaina. Para facilitar las interacciones entre las proteínas de la vaina de la cola en la cola, las dos extensiones largas de la vaina central (la extensión N-terminal, residuos M1-S21; la extensión C-terminal, residuos A667-G689) pueden conectarse a la C-terminal dominios de dos proteínas gp118 adyacentes ubicadas en el anillo de abajo (Fig. 3d). Además, el dominio C-terminal puede conectarse con dos proteínas de cubierta adyacentes ubicadas en el anillo superior (Fig. 3b, panel inferior derecho). Por lo tanto, tres proteínas de cubierta de dos capas diferentes se unen dentro de una llamada cresta (Fig. 3d). El componente de la vaina central no puede interactuar entre sí dentro de un anillo en la misma capa, y todas las interacciones entre los anillos se limitan a las crestas (Fig. 3a, d). Las estructuras atómicas muestran que las extensiones de la vaina pueden crear una "malla" (Fig. 3d).

El tubo de otros sistemas de inyección contráctiles, como el fago T430, las piocinas tipo R31, el profago antialimentación de Serratia entomophila (afp)32 y el sistema de secreción bacteriano Tipo VI (T6SS)33,34, muestran la capacidad de translocar diferentes sustratos y el la naturaleza del sustrato determina las propiedades del canal del tubo30. El tubo del fago ϕKp24 muestra una función similar.

La estructura de la proteína del tubo (gp119, número de acceso QQV92088.1, Fig. 4a) se predijo utilizando AlphaFold2 y se ajustó de manera flexible en el mapa EM de cola ϕKp24. Usamos gp119 para construir un modelo del tubo del fago ϕKp24. Una estructura en forma de anillo que consta de seis proteínas tubulares representa una unidad de ensamblaje del tubo interno del fago ϕKp24 (Fig. 4b, c). Hay dos características más destacadas de gp119: (1) la extensión C-terminal larga puede alcanzar otra gp119 ubicada en la capa directamente arriba (hacia la cápside); (2) el dominio N-terminal puede extenderse a un gp119 vecino en un mismo disco (Fig. 4b). En comparación con el monómero gp19 de la proteína del tubo del fago T4 (PDB: 5W5F), gp119 no muestra similitud de secuencia pero sí un plegamiento similar en su núcleo (gp19 tiene una extensión C-terminal más corta y un dominio N-terminal más pequeño) (Fig. 21a complementaria) . Tanto gp119 como gp19 tienen dos capas de láminas β en común. Además, dos láminas anti β largas pueden extenderse a la proteína tubular vecina en el mismo disco. (Fig. 21 complementaria). La superficie interna del tubo muestra una carga negativa prominente (Fig. 4d), lo que evita que el ADN del fago con carga negativa se adhiera a la superficie.

un diagrama de cinta del modelo AlphaFold2 predicho del monómero de proteína de tubo gp119 de ϕKp24, con los colores del arco iris en ChimeraX. b Diagrama de cinta de dos discos (hexámeros) en el tubo del fago ϕKp24, se mostró una gp119 típica en el color del arco iris. c Vista en corte como diagrama de cinta de la estructura del tubo (tres discos). d diagramas electrostáticos que muestran la superficie interna de la estructura del tubo en c. Distribución de carga: rojo = negativo; azul = positivo; blanco = neutro. El potencial electrostático se coloreó en ChimeraX. e Vistas laterales de la interfaz entre una parte de la proteína de la vaina (dominio C-terminal de la vaina central) y cuatro subunidades de proteína tubular. El residuo R623 de gp118 puede interactuar con el residuo D268 de gp119 usando un puente salino (el cuadro rectangular ampliado, panel superior izquierdo). f La superficie cargada de e. g Una vista de libro abierto de f. Los parches complementarios de cargas que interactúan tanto en la vaina como en el tubo están marcados con óvalos.

Las interacciones funda-tubo pueden surgir de fuerzas electrostáticas y no covalentes y de la viscosidad en el espacio a nanoescala (agua intersticial) entre el tubo de cola y la funda circundante35. Las fuerzas electrostáticas son en gran medida perpendiculares al eje del tubo de cola y, por lo tanto, contribuyen a la conexión entre la funda y el tubo de cola. Para el fago ϕKp24, la vaina interactúa a través de enlaces de hidrógeno con el tubo interior: el residuo R623 de la proteína de la vaina gp118 puede interactuar con el residuo D268 de la proteína del tubo gp119 a través de un puente salino (Fig. 4e). Además, la proteína de vaina gp118 se conecta con las subunidades del tubo interno mediante interacción electrostática (Fig. 4g). La superficie exterior de las subunidades del tubo muestra un parche con carga positiva (Fig. 4g, panel derecho). El dominio C-terminal de la proteína de la vaina se une al parche del tubo a través de un parche complementario con carga negativa en una de sus dos hélices α.

Se sabe que el tubo de la cola tiene un papel fundamental en el ensamblaje de la vaina en el estado extendido de las colas del fago36. De manera similar a otros sistemas de cola de fago, proponemos que el ensamblaje de la vaina de ϕKp24 comience desde la placa base, como es el caso del fago T437. El tubo y la placa de base pueden formar una "plataforma" a la que se une el primer disco de subunidades de vaina. Posteriormente, el tubo y el disco de las subunidades de vaina extendida sirven de andamio para el montaje del resto de la vaina. Por lo tanto, el ensamblaje del estado contraído se evita mediante la creación de una plantilla en la que las subunidades de la vaina interactúan a lo largo de la cresta sin ningún contacto lateral (Fig. 3d). Este ensamblaje impulsado por plantilla probablemente da como resultado una estructura oligomérica metaestable, que la placa base podría desbloquear para la contracción de la cola al interactuar con la superficie de la célula objetivo.

Para investigar las estructuras y los cambios conformacionales de las fibras de la cola durante la unión celular y la inyección del genoma, utilizamos cryo-ET. Tomamos imágenes de ϕKp24 junto con su huésped K. pneumoniae y observamos fagos intactos en cuatro estados diferentes: partículas libres con y sin ADN y partículas adsorbidas con y sin ADN. Estos cuatro estados corresponden a cuatro estados diferentes durante la infección por fagos: fagos libres, fagos de infección temprana adheridos al huésped, fagos posteriores a la infección (vacíos) aún adheridos a la célula y fagos libres posteriores a la infección (vacíos). Una imagen crio-ET 2D representativa (Fig. 5a) muestra varios de estos estados. Para encontrar las arquitecturas de las fibras desordenadas en diferentes momentos durante el proceso de infección, nos enfocamos en ϕKp24 intacto unido a una célula de K. pneumoniae. Seleccionamos y extrajimos fagos intactos de 89 reconstrucciones 3D sin ruido en IMOD38.

una imagen crio-ET 2D que muestra varios estados diferentes del fago ϕKp24 en su entorno nativo: fagos libres (fagos con cápsides oscuras, flecha azul), fagos de infección temprana (fagos con cápsides oscuras y adheridos a la membrana del huésped, flecha negra), medio - fagos de infección (fagos con cápsides semioscuras y adheridas a la membrana del huésped, flecha verde) y fagos posteriores a la infección (vacíos) aún adheridos a la célula (flecha blanca). b Tomogramas recortados del fago ϕKp24 y segmentaciones manuales. La primera columna muestra siete tomogramas representativos de ϕKp24 en diferentes estados durante la inyección. De arriba a abajo, el primer tomograma muestra un fago libre (cápside llena), el segundo al cuarto tomogramas muestran fagos de infección temprana (cápsides llenas) adheridos a una célula, y el quinto al séptimo tomogramas muestran fagos posteriores a la infección (cápsidas vacías). cápsides) unidas al huésped. La segunda columna muestra siete segmentaciones manuales de las fibras de la cola correspondientes a los tomogramas que se muestran a la izquierda. La vaina es de color púrpura, las fibras son de color cian y el tubo es de color amarillo. La tercera columna muestra la vista lateral de cada segmento izquierdo después de una rotación de 90°.

Debido a la alta complejidad y la naturaleza heterogénea de las fibras de la cola, optamos por segmentar manualmente las fibras de la cola utilizando la función de segmentación IMOD38. Primero extrajimos subvolúmenes de fagos individuales de los tomogramas completos (Fig. 5b). Aquí, nuestro objetivo fue seleccionar fagos que se encontraban en diferentes etapas de infección, desde el estado anterior al posterior a la infección. Luego segmentamos las colas de fago de estos fagos (Fig. 5b) y comparamos su arquitectura general. Descubrimos que las fibras del fago previo a la infección están dispuestas alrededor de la placa base en una organización casi esférica. Por el contrario, cuando los fagos se adhieren a una célula huésped, las fibras interactúan con los sitios de unión en la envoltura celular, cambiando la arquitectura general. Las fibras de la cola se organizan a lo largo de la superficie celular, creando una "placa de cola" plana. Además, observamos que la cola de los fagos adheridos no está dispuesta verticalmente con respecto a la envoltura celular. En cambio, está inclinado, aunque esto podría ser un artefacto de la preparación de la muestra, también es posible que la inyección del genoma se produzca en ángulo en algunos casos.

Debido a la lenta segmentación manual de las fibras de la cola, creamos una red neuronal39 para detectar automáticamente las fibras de la cola del fago ϕKp24 en tomogramas reconstruidos. Entrenamos la red utilizando las segmentaciones manuales de las fibras de la cola y, después de varias rondas de optimización, aplicamos la red entrenada a todos los tomogramas, generando mapas 3D que contienen estructuras de fibra de la cola. Definimos los fagos previos a la infección de la siguiente manera: (1) la cápside está llena, (2) la cola está extendida, (3) el fago está intacto y (4) el fago no está en contacto con una célula bacteriana. De manera similar, definimos los fagos posteriores a la infección de la siguiente manera: (1) la cápside está vacía, (2) la cola está contraída y (3) hay algunas conexiones entre las puntas de las fibras y la membrana celular. Después de la extracción y la conversión de formato, se generaron 89 estructuras de fibra de cola de fago antes de la infección y 338 estructuras de fibra de cola de fago adherido después de la infección. Se seleccionan 40 estructuras de fibras de la cola representativas de antes de la infección y estructuras de fibras de la cola de después de la infección mediante inspección visual y se muestran en las Figs complementarias. 24, 25. Estas estructuras 3D muestran claramente que cada estructura de fibra de la cola tiene una conformación diferente. En el grupo de fagos previo a la infección (Fig. 24 complementaria), las fibras de la cola están dispuestas alrededor de la placa base en una disposición casi esférica. El rango de tamaño de las estructuras de las fibras de la cola es de aproximadamente 110 a 130 nm de altura, 150 a 170 nm de longitud y 90 a 130 nm de espesor. En el grupo de fagos posterior a la inyección (Fig. 25 complementaria), la mayoría de las estructuras de fibras de la cola están dispuestas en una configuración ovalada en forma de disco. El rango de tamaño en 3D es de 120 a 150 nm de altura, de 160 a 190 nm de longitud y de 60 a 100 nm de grosor.

Para revelar aún más los cambios conformacionales de las fibras de la cola en las etapas previas y posteriores a la infección, los mapas dentro de cada grupo se alinearon entre sí y se promediaron para producir formas de fibra "canónicas". Finalmente, obtuvimos las estructuras superpuestas en 3D de las fibras de la cola antes de la infección (Fig. 6a) y después de la infección (Fig. 6b), que muestran claramente un cambio conformacional en la fibra de la cola de una forma casi esférica a un disco plano. Entre estas configuraciones, el espesor cambia en aproximadamente 40 nm. Además, la cola de la estructura superpuesta posterior a la infección no es perpendicular al disco de las fibras, lo que sugiere que la cola no está orientada de forma perpendicular a la superficie del huésped durante la inyección de ADN. Esto también es evidente en las estructuras individuales de las fibras de la cola y las segmentaciones manuales. Hemos realizado una animación que ilustra la unión del fago ϕKp24, la reorganización de las fibras de la cola y la eyección de ADN (Película complementaria 2).

una estructura superpuesta en 3D de las fibras de la cola en fagos previos a la infección. Se alinearon y promediaron 89 estructuras de fibras de la cola de fagos previos a la infección. La imagen de la derecha muestra la vista lateral de la estructura después de una rotación de 90°. Tanto el cuadro exterior como la línea roja son barras de escala con unidad de píxel. El tamaño del cuadro cuadrado exterior es de 200 píxeles, el tamaño de píxel es de 1.312 nm. El tamaño de la estructura de la fibra de la cola es ~137,8 nm de longitud, 78,7 nm de altura y 104,9 nm de espesor. b Estructura superpuesta en 3D de las fibras de la cola en fagos posteriores a la infección. Se alinearon y promediaron 338 estructuras de fibras de la cola de fagos post-infección adheridos al huésped. La estructura de las fibras de la cola se asemeja a un disco aplanado. El tamaño es de 177,1 nm de longitud, 118,1 nm de altura y 65,6 nm de espesor. c Diagrama esquemático de la vaina del fago (púrpura), el tubo interior (amarillo) y la estructura de las fibras de la cola (cian). Aquí definimos la altura, la longitud y el grosor de la estructura.

Se utilizó una colección de cepas con 77 serotipos capsulares (tipo K) diferentes para caracterizar la infectividad de ϕKp24. Este análisis reveló nueve cepas representativas de serotipos (K2, K13, K19, K25, K35, K46, K61, K64 y K81) susceptibles a ϕKp24 con una eficiencia de siembra que oscila entre 1 y 0,001 en comparación con la cepa huésped ϕKp24 (Fig. 26 y datos complementarios 1). Sin embargo, la similitud de secuencia40 y el modelo de homología basado en la estructura41 sugieren que el fago transporta catorce proteínas de fibra de la cola (gp168, gp196, gp294, gp295, gp300, gp301, gp303, gp304, gp306, gp307, gp308, gp309, gp310 y gp313; Tabla 1) en lugar de los nueve previamente previstos11. Estas proteínas poseen supuesta actividad despolimerizante (liasa o hidrolasa) y un pliegue helicoidal β, que es una característica distintiva de las despolimerasas del fago de Klebsiella. Para cinco de ellos, se puede predecir un serotipo K putativo basado en la similitud de la secuencia de aminoácidos con las despolimerasas verificadas experimentalmente (Tabla 1). El modelado de las catorce proteínas con RoseTTAFold42 reveló una forma sobresaliente alargada típica compuesta de cadenas β paralelas ortogonales al eje largo (Fig. 7, Datos complementarios 2).

Una delineación esquemática de los diferentes módulos en 14 fibras de cola predichas da como resultado cuatro grupos (G1, G2, G3 y G4) según la longitud de sus módulos estructurales. Tenga en cuenta que las orientaciones relativas de los dominios individuales en la estructura predicha pueden ser diferentes a las representadas. b Catorce estructuras de fibras de la cola predichas. Las fibras de la cola con actividad despolimerasa se componen típicamente de módulos estructurales responsables de la unión y ramificación de la cola (azul), una hélice α de separación (verde) y una hélice β con actividad enzimática (amarillo). c Un modelo de hiperramificación de las fibras de la cola de ϕKp24.

Los fagos del grupo 8 de Menlow (KpS110 y 0507-KN2-1) y el grupo 6 del fago ΦK64-1 (ΦK64-1 y RaK2) son los fagos de Klebsiella con el aparato de fibra de la cola más elaborado descrito hasta ahora, que comprende entre cinco y once fibras de la cola. . El extremo N (Fig. 7, elementos azules) de las fibras de la cola del fago de Klebsiella generalmente tiene una función estructural involucrada en la unión a las colas del fago oa otra fibra de la cola o proporciona un sitio de acoplamiento para otras fibras de la cola8. El extremo C (Fig. 7, elementos amarillos) contiene el dominio de la despolimerasa enzimática que define la especificidad del serotipo de la cápsula y presenta un pliegue helicoidal β. El extremo C también puede incluir chaperonas adicionales o dominios de unión a carbohidratos43,44,45,46,47. Los extremos N y C suelen estar separados por una hélice α48 (Fig. 7, elementos verdes). Las catorce despolimerasas putativas de ϕKp24 se dividieron en cuatro grupos (G1-G4) en función de la longitud de la parte estructural N-terminal. La parte N-terminal más larga de gp306 indica que gp306 (G1) es la fibra principal de la cola. En nuestro modelo (Fig. 7c), su gran dominio estructural N-terminal une el sistema completo de fibras de la cola hiperramificadas a la placa base y sirve como un sitio de acoplamiento para las fibras secundarias de la cola (sistema de ramificación) a través de dominios similares a T4gp10 específicos. Estos dominios fueron previamente confirmados experimentalmente en los sistemas ramificados de fibra de la cola del fago G7C49 y CBA12050. Las fibras secundarias de la cola pueden comprender sitios de acoplamiento adicionales para las fibras terciarias de la cola, como se describe para los fagos que pertenecen al grupo de fagos de Menlow8. Como tal, los cuatro grupos diferentes corresponden a posiciones más periféricas en la disposición de las fibras de la cola. El análisis HHPred51 (datos complementarios 2) detectó en gp306 (G1) y gp301 (G2) la presencia de un pliegue largo similar a T4gp10 que comprende sitios de acoplamiento para más de una fibra de cola. El grupo 3 (G3) contiene nueve proteínas (gp168, gp196, gp300, gp303, gp304, gp307, gp308, gp309 y gp310) con una estructura N-terminal más corta pero suficiente para albergar un dominio responsable de la unión a un sitio de acoplamiento. Sólo una fibra de la cola con actividad despolimerasa predicha posee un péptido N-terminal corto (51 aa) que precede a la hélice α de separación, es decir, gp313 (G4). Este péptido podría mediar en la unión a otra fibra de la cola. En conjunto, la arquitectura de fibra de cola de ϕKp24 parece estar organizada en capas periféricas hiperramificadas con gp306 actuando como la fibra de cola principal.

El creciente problema de la resistencia a los antibióticos en los patógenos bacterianos generó un interés renovado en el uso de fagos para tratar infecciones bacterianas resistentes a los antibióticos. Para el uso óptimo de fagos en aplicaciones terapéuticas, necesitamos mejorar nuestra comprensión de su estructura y función. El fago ϕKp24 de Klebsiella descrito recientemente es un fago candidato prometedor con una gama de huéspedes ampliada, que infecta al menos nueve tipos capsulares diferentes y probablemente incluso más en función de las catorce fibras de la cola pronosticadas con actividad despolimerasa.

Desentrañar la morfología única representa un desafío para los estudios estructurales detallados. Especialmente el gran tamaño de la cápside y la naturaleza heterogénea de las fibras de la cola plantean un desafío para la recopilación y el análisis de datos. Requieren la combinación de diferentes métodos estructurales para resolver la estructura general. Los algoritmos de predicción de estructuras de proteínas, como AlphaFold2 y RoseTTAFold, se han convertido en herramientas invaluables para la elucidación de estructuras macromoleculares basadas en crio-EM. Además, el aprendizaje automático proporciona una nueva forma de analizar datos de imágenes complejos de cryo-ET. En este estudio, combinamos el análisis de partículas individuales y la tomografía crioelectrónica con la predicción de la estructura de proteínas, las simulaciones moleculares y el aprendizaje automático. Esto nos permitió descubrir la estructura de la partícula ϕKp24, así como los cambios morfológicos característicos que sufre el fago durante la infección del huésped.

El gran tamaño, especialmente de la cápside, junto con una gran cantidad de datos, también plantean desafíos computacionales durante el procesamiento de datos. Más específicamente, el diámetro de la cápside de ϕKp24 es de alrededor de 1450 Å. De acuerdo con el gradiente descendente de la curva FSC en Relion, el conjunto de datos utilizado para el refinamiento 3D final tuvo que dividirse en 1,5 veces para equilibrar la resolución final con los recursos computacionales disponibles. La cápside vacía se reconstruyó con una resolución de 4,1 Å, que es la resolución más alta que podemos esperar de las partículas debido al tamaño de píxel (2,055 Å). La cápside vacía de ϕKp24 es actualmente la cápside de mayor resolución de cualquier fago gigante depositado en el EMDB (el banco de datos de microscopía electrónica).

El principal componente estructural de la cápside es la MCP gp372. Esta proteína inusualmente grande es la base de los hexámeros y pentámeros que forman la cápside. Por lo general, las cápsides de los fagos se componen de una (o dos) MCP y proteínas decorativas (proteínas externas adicionales que unen las MCP). Nuestra reconstrucción de la cápside de ϕKp24 ha demostrado que toda la cápside de ϕKp24 se puede ensamblar con un solo MCP.

En los hexámeros, los seis bucles C-terminales largos forman un poro en el centro de un hexámero. Hasta donde sabemos, no se ha informado antes de un poro similar en otras cápsidas de fagos. La función exacta de este poro no está clara actualmente. Sin embargo, se han informado poros en virus, por ejemplo en el VIH-1. Este virión utiliza poros dinámicos de la cápside para importar nucleótidos y alimentar la síntesis de ADN encapsulado52. Especulamos que el poro de ϕKp24 puede estar involucrado en el equilibrio de las diferencias de presión durante la carga del ADN en la cápside, o durante la eyección del ADN cuando aumenta el tamaño de la cápside.

Está surgiendo un vínculo evolutivo entre algunas proteínas de cola de fago y el sistema de secreción de bacterias Gram negativas tipo VI (T6SS) que está implicado en varios procesos relacionados con la virulencia53,54,55. La estructura de la vaina contráctil que se informa aquí muestra fuertes similitudes con otros sistemas contráctiles, como el tipo R pyocin31 y T430. Esto sugiere que la cola helicoidal del fago ϕKp24 funciona de manera similar. Además, la estructura resuelta aquí sugiere que las extensiones de conexión de subunidades (extensión C-terminal) de la proteína de vaina gp118 funcionan como bisagras durante la contracción, con la vaina central de gp118 probablemente manteniendo su estructura. La reorganización de las subunidades de la vaina tras la contracción conduce a una estructura mucho más densa. Aquí, las crestas se juntan para quedar parcialmente interdigitadas. En la cola contraída, se pierden las conexiones con el tubo interno, lo que permite que el tubo se inserte en la membrana de la célula diana durante la infección31.

Los tomogramas revelan que las colas de los fagos adheridos no aparecen verticales con respecto a la envoltura celular. En cambio, las colas de los fagos con cápsides llenas o vacías están inclinadas. Si bien no podemos descartar que esta observación sea un artefacto de la preparación de la muestra, este archivo adjunto puede ser fisiológicamente relevante. Una cola inclinada puede reducir la energía necesaria para la contracción y la eyección del ADN, así como el daño a la envoltura celular para evitar la lisis prematura del huésped.

A diferencia de la cápside y la cola, las fibras de la cola son estructuralmente muy heterogéneas y no son aptas para el análisis de partículas individuales. Mediante el uso de una red neuronal que está diseñada específicamente para un entrenamiento preciso con un número limitado de ejemplos56, pudimos entrenar una red utilizando las segmentaciones de las fibras de la cola de solo siete partículas de fago, lo que limita la segmentación manual que requiere mucha mano de obra. Después del entrenamiento, la red permitió el análisis automático de las fibras de la cola de más de 600 fagos, demostrando las posibilidades del aprendizaje automático para ayudar en el análisis de estructuras complejas.

Los datos de las fibras de la cola revelaron la exquisita complejidad de estas fibras de la cola y un cambio significativo en su disposición entre los fagos libres y los unidos a una célula huésped. Mientras que las fibras se organizan como una esfera alrededor de la punta de la cola de un fago libre, en los fagos unidos al huésped, las fibras de la cola se ajustan a la envoltura del huésped y forman una placa. En particular, el cambio en la conformación de las fibras de la cola precede a la liberación de ADN. Por lo tanto, puede ser parte del propio mecanismo de activación.

El análisis del rango de huéspedes de ϕKp24 reveló un número sin precedentes de serotipos de cápsulas a los que se dirige este fago. Esta observación corresponde a las múltiples fibras de la cola con actividad despolimerasa específica predicha en el genoma del fago grande y el sistema de fibra de la cola altamente ramificado que se pudo visualizar. El análisis estructural de las fibras de la cola indica una arquitectura estructural extensa para integrar todas las fibras de la cola en la partícula del fago con gp306 emergiendo como el principal candidato a fibra de la cola haciendo contacto directo con la cola del fago, mientras que los grupos posteriores de fibras de la cola tienen un dominio estructural cada vez más acortado. , insinuando una ubicación más periférica.

En resumen, los conocimientos adquiridos a partir de esta nueva combinación de diversos métodos proporcionan una base esencial para el desarrollo de posibles aplicaciones clínicas. Recientemente, la terapia con fagos se ha aplicado con éxito para tratar una infección causada por una cepa de K. pneumoniae resistente a panfármacos13. El amplio rango de huéspedes de ϕKp24 determinado aquí puede convertirlo en un candidato atractivo para el desarrollo de la terapia con fagos.

Las cepas de referencia de K. pneumoniae utilizadas en este estudio (Datos complementarios 1) se obtuvieron de la Colección de l'Institut Pasteur (CIP, París, Francia, cepas etiquetadas por el CIP) o se compraron en la Colección Nacional de Cultivos Tipo (cepas etiquetadas por el NCTC) . Las bacterias se almacenaron a -70 °C en Trypticase Soy Broth (TSB, Becton Dickinson and Company, Cockeysville, MD, EE. UU.) complementado con 20 % de glicerol.

El fago ϕKp24 (número de acceso de Genbank MW394391) se aisló previamente de aguas residuales11. ϕKp24 se cultivó en 2 l de caldo de lisogenia (LB) utilizando la cepa K5962 de K. pneumoniae como huésped (número de acceso de Genbank Bioproject PRJNA745534). El cultivo resultante se centrifugó (9000 xg, 15 min) y el sobrenadante que contenía el fago se esterilizó por filtración. A continuación, el lisado de fago se lavó con tampón SM (NaCl 100 mM, MgSO4 8 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 7,5) y se concentró 10 veces con un casete de flujo tangencial (100 kDa PES Vivaflow 200, Sartorius, Alemania). El título de fagos se determinó mediante diluciones seriadas de la solución de fagos en placas de agar de doble capa de la cepa K5962 para la detección de fagos.

Se usó el método puntual para determinar la especificidad del serotipo y la producción potencial de despolimerasas que se dirigen a la cápsula por el fago ϕKp24. Los análisis se realizaron en la colección de serotipos de K. pneumoniae (Datos complementarios 1, 2). Los cultivos bacterianos de la noche a la mañana se suspendieron en TSB fresco, se incubaron durante 2 horas a 37 °C con agitación (140 rpm) y se vertieron en placas de Trypticase Soy Agar (TSA, Becton Dickinson and Company, Cockeysville, MD, EE. UU.). Después del secado, 10 µl de diluciones en serie de diez veces del fago ϕKp24 (109 UFP/ml como concentración inicial) se colocaron sobre césped bacteriano. Después de una incubación durante la noche a 37 °C, se inspeccionaron los céspedes en busca de zonas de placa y halo. La eficiencia del cultivo en placa se calculó dividiendo el título del fago en la dilución terminal en la cepa de prueba por el título del mismo fago en su cepa huésped.

La secuencia genómica del fago ϕKp24 se obtuvo de la base de datos GenBank (Nº de Acceso NCBI MW394391). Todas las proteínas del fago ϕKp24 se analizaron con Phyre241 en busca de supuestas fibras de la cola con actividad despolimerasa. Los criterios para la predicción de la supuesta actividad despolimerasa fueron como en 8 con algunas modificaciones: (1) la proteína tiene más de 200 residuos; (2) la proteína está anotada como cola/fibra de cola/punta de cola/proteína hipotética en la base de datos del NCBI; (3) la proteína muestra homología con los dominios anotados como liasa [hialuronato liasas (hialuronidasas), pectina/pectato liasas, alginato liasas, K5 liasas] o hidrolasa (sialidasas, ramnosidasas, levanasas, dextranasas, xilanasas, glucosidasa, galacturonasa, galacturonosidasa, glucanasa ) con una confianza de al menos 40% en Phyre2; (4) la longitud de la homología con uno de estos dominios enzimáticos debe abarcar al menos 100 residuos; (5) Phyre2 debería predecir una estructura β-helicoidal típica. Las proteínas predichas se modelaron con RoseTTAFold42. Los modelos predichos se analizaron más a fondo y se eligió la última hélice α antes de la estructura helicoidal β como punto final para la parte estructural N-terminal. Las proteínas se clasificaron según la longitud de la parte estructural N-terminal, comenzando por la más larga. Las proteínas se analizaron adicionalmente con BlastP40 y HMMER57. BlastP se utilizó para determinar la especificidad del serotipo en función de las similitudes de la secuencia de aminoácidos de las despolimerasas encontradas en la base de datos. Se determinaron los siguientes criterios para el análisis: (i) la proteína homóloga debe tener una actividad despolimerasa confirmada y especificidad para el serotipo particular de K. pneumoniae, (ii) la identidad de la secuencia de aminoácidos debe exceder el 30 % y (iii) la longitud de la homología debe ser más de 100 aminoácidos. El extremo N de cada proteína seleccionada se analizó con HHPred51,58 usando alineación por pares en busca de dominios similares a T4gp10. Se utilizaron los parámetros por defecto: Método de generación de MSA: HHblits = >UniRef30; iteraciones de generación de MSA: 3; Límite de valor E para la generación de MSA: 1e-3; Min seq identidad de coincidencias de MSA con consulta (%): 0; Cobertura mínima de aciertos de MSA (%): 20; Puntuación de la estructura secundaria: during_alignment; Modo de alineación: Realinear con MAC: local: no realinear; Umbral de realineación MAC: 0,3; Aciertos máximos al objetivo: 250; Probabilidad mínima en la lista de aciertos (%): 20. La alineación se realizó contra T4gp10 (NP_049768.1), el extremo N de CBA120gp163 (orf 211, YP_004957865.1), CBA120gp165 (orf 213, YP_004957867.1) y G7Cgp66 (YP_00) 4782196 .1).

K. pneumoniae K5962 se cultivó durante la noche a 30 °C con agitación a 180 rpm. El cultivo de toda la noche se usó para inocular 10 ml de medio LB nuevo y se cultivó durante 2 horas a 30 °C, 180 rpm. Posteriormente, se añadieron al cultivo 1,6 mL del fago ϕKp24 (9 × 1012 UFP/mL) y se incubó durante 80 min más. El cultivo se comprobó visualmente para confirmar la lisis celular y se centrifugaron 200 µl (5000 xg, 5 min) y el sedimento se resuspendió en el mismo volumen de medio fresco. Finalmente, se añadieron 5 µl de perlas de oro de 10 nm de tamaño (Cell Microscopy Core, Universidad de Utrecht, Utrecht, Países Bajos) a 50 µl de la mezcla de bacterias y fagos preparada. Con el Leica EM GP (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania), se aplicaron 3,8 µl de la mezcla a una rejilla de cobre de malla 200 Quantifoil R2/2 con descarga luminiscente (Quantifoil Micro Tools GmbH, Jena, Alemania) y se incubó 30 s antes de la transferencia. a 20 °C con ~95% de humedad relativa. Las rejillas de bacterias y fagos se secaron durante 1 segundo y se sumergieron automáticamente en etano líquido. Las muestras vitrificadas se transfirieron a cajas de almacenamiento y se almacenaron en nitrógeno líquido hasta su uso.

ϕKp24 se concentró de la siguiente manera: se centrifugaron 1000 µl de líquido ϕKp24 de fago (9 × 1012 PFU/mL) a una velocidad más baja (5 k) durante 2 o 3 veces (15 min/por centrifugado) hasta que el tampón dejó de eluirse de un concentrador de proteínas (filtro de celulosa de 10 kDa). Posteriormente, la muestra se usó inmediatamente para la congelación por inmersión. Con el Leica EM GP, se añadieron 3,5 µl del fago concentrado a una rejilla de cobre de malla 200 Quantifoil R2/2 descargada luminiscente, se incubó durante 10 s a 18 °C con una humedad relativa del ~95 %. Las rejillas de fagos se secaron durante 0,7 sy se sumergieron automáticamente en etano líquido. Las muestras vitrificadas se almacenaron en nitrógeno líquido hasta su uso.

Las rejillas que contenían K. pneumoniae K5962 y ϕKp24 se recortaron y cargaron en un Titan Krios (Thermo Fisher Scientific (TFS)) equipado con un detector de electrones directos K3 BioQuantum y un filtro de energía (Gatan, Inc), que se configuró en imágenes de pérdida cero. con un ancho de rendija de 20 eV. Los objetivos de las imágenes se eligieron mediante la selección de células bacterianas que se encontraban en un orificio de la película de carbono de la rejilla EM. Las bacterias que aparecían menos densas a bajo aumento indicaban una infección por fagos avanzada. Los datos se recopilaron como pilas de fotogramas de películas usando SerialEM ajustado a un esquema de inclinación simétrica de dosis entre −54° y 54°, con incrementos de inclinación de 2°59,60. El aumento nominal seleccionado fue de 26.000, que corresponde a un tamaño de píxel de 3,28 Å en las imágenes recopiladas. El desenfoque de los datos recopilados osciló entre −4 y −6 µm. La dosis total estimada por serie de inclinación fue de 100 e/Å2.

Las rejillas que contenían ϕKp24 se recortaron y cargaron en un microscopio electrónico Titan Krios (Thermo Fisher Scientific, TFS) operado a 300 kV, equipado con un detector de electrones directo Gatan K3 BioQuantum (Gatan). Las películas se grabaron utilizando EPU (Thermo Fisher Scientific, TFS) y AFIS (cambio de imagen sin aberraciones) en modo de superresolución con un aumento nominal de 64 000, correspondiente a un tamaño de píxel calibrado de 0,685 Å con un rango de desenfoque de −1 a −5 µm y una dosis total de 30 e/Å2 (consulte los parámetros de recopilación de datos en la Tabla complementaria 1).

La corrección de movimiento, la alineación de fotogramas, la alineación de series de inclinación utilizando fiduciales de oro y la reconstrucción de tomogramas se llevaron a cabo utilizando IMOD38. Los conjuntos de datos se agruparon por un factor de 2. A partir de los tomogramas reconstruidos, los fagos ϕKp24 con placas base claramente visibles y las fibras de la cola se seleccionaron para la segmentación utilizando IMOD. La visualización de datos fue realizada por IMOD y Fiji61.

La cápside del fago ϕKp24 se reconstruyó usando Relion 3.1.213. MotionCorr62 se utilizó para corregir el movimiento de partículas inducido por el haz. La función de transferencia de contraste fue estimada por CTFFIND 4.1.1863. Inicialmente, se seleccionaron manualmente 61 partículas de la cápside para clasificarlas en 2D a fin de generar plantillas de referencia para la selección automática. A continuación, se utilizó la selección automática de Relion para seleccionar automáticamente 290 280 partículas, que se clasificaron en 4 para la clasificación 2D durante la extracción. Después de varias rondas de clasificación 2D, las partículas con características de falso positivo y contaminantes se descartaron, lo que dio como resultado un conjunto de datos de 28 090 partículas, que luego se clasificó en dos clases: cápsides vacías y cápsides llenas. Para equilibrar la resolución final y la velocidad de cálculo, el conjunto de datos se muestreó 1,5 veces con un tamaño de píxel final de 2,055 Å, una caja de partículas de 800 píxeles y un diámetro de máscara circular de 1600 Å. Las partículas extraídas luego se sometieron a un modelo y clasificación inicial en 3D. La clase con el mayor número de partículas se usó para el refinamiento 3D final (esto separa y elimina las cápsidas parcialmente llenas de ADN). Finalmente, elegimos la clase de cápside vacía y la clase de cápside completa para el refinamiento 3D por separado usando simetría icosaédrica I1, y se aplicó la corrección de esfera de Ewald usando un algoritmo de procesamiento de imagen de banda lateral única64 después del refinamiento 3D. Las reconstrucciones finales se afilaron y filtraron localmente mediante el procesamiento posterior de Relion (flujo de trabajo de reconstrucción 3D, figura complementaria 2a). La resolución del mapa se estimó en el criterio de 0,143 de la curva FSC corregida por aleatorización de fase calculada entre dos semimapas refinados de forma independiente multiplicados por una máscara de disolvente de bordes suaves. Los mapas se visualizaron utilizando UCSF ChimeraX27.

La reconstrucción helicoidal se llevó a cabo utilizando RELION 3.1.213. La cola ϕKp24 conectada a una cápside completa se recogió manualmente. Se extrajeron un total de 4707 segmentos seleccionados manualmente con una caja de 450 píxeles y luego se clasificaron en 2D. El valor de giro inicial se aproximó a partir de la distancia de cruce observada en micrografías sin procesar y promedios de clase 2D. La mayor proporción de las clases con límites claros se utilizó como plantilla para la selección automática final. Los parámetros para la selección automática helicoidal se optimizaron en un subconjunto de 741 micrografías. Después de la selección automática de todo el conjunto de datos, 114 132 partículas fueron extraídas y agrupadas por 2. Se realizaron múltiples rondas de clasificación 2D para eliminar las partículas positivas falsas y las características contaminantes. Las partículas restantes se sometieron a varias rondas de clasificaciones en 3D utilizando un cilindro sin características como modelo 3D inicial. Se realizó un refinamiento tridimensional, seguido de una clasificación 3D donde las partículas se clasificaron en cuatro clases. Se seleccionaron las partículas de la clase con el mayor número, se extrajeron de nuevo utilizando datos no agrupados y se refinaron en 3D con simetría C6. Los parámetros de elevación y torsión helicoidales para el refinamiento 3D final se analizaron con HI3D25 del laboratorio de Jiang (Tabla complementaria 1), la elevación y torsión helicoidales se determinan a 39,03 Å y 20,89°, respectivamente. Las reconstrucciones finales se afilaron y filtraron localmente mediante el procesamiento posterior de Relion (flujo de trabajo de reconstrucción helicoidal, figura complementaria 11). La resolución local se generó en ResMap65 (Fig. 12 complementaria).

Las estructuras 3D de las proteínas ϕKp24 se infirieron utilizando Alphafold v2.0 a través del cuaderno ColabFold66 en: https://colab.research.google.com/github/sokrypton/ColabFold/blob/main/AlphaFold2.ipynb. Los modelos iniciales de los conjuntos de hexámero y pentámero de la cápside se construyeron mediante el acoplamiento rígido del modelo gp372 predicho por AlphaFold2 en las regiones correspondientes del mapa crio-EM de la cápside utilizando ChimeraX. Luego, los modelos ensamblados se refinaron por separado utilizando el protocolo MDFF en cascada67, que realiza simulaciones secuenciales de MDFF en una serie de mapas suavizados por Gauss de resolución creciente, que finaliza con el mapa experimental. Se llevaron a cabo un total de simulaciones MDFF de 5 × 1 ns para cada ensamblaje con restricciones de simetría aplicadas a los átomos de la columna vertebral de cada monómero. Luego, el modelo de hexámero resultante se acopló a las densidades que rodean los ensamblajes de hexámero y pentámero para producir modelos de cápside extendidos, que luego se sometieron a una simulación MDFF adicional de 5 ns. Todas las simulaciones se realizaron utilizando NAMD v2.1468 y el campo de fuerza CHARMM3669. Las simulaciones MDFF se realizaron en el conjunto NVT a 300 K y utilizando solvente implícito Born generalizado. Todos los átomos de la columna vertebral se ajustaron al mapa de densidad utilizando una constante de acoplamiento de 0,3 con restricciones armónicas adicionales aplicadas para evitar la pérdida de estructura secundaria, errores de quiralidad y la formación de enlaces peptídicos cis. Los parámetros adicionales se tomaron como valores predeterminados proporcionados por el complemento MDFF en VMD70.

La estructura gp118 pronosticada por AlphaFold2 se ajustó rígidamente en el mapa de densidad de la cola utilizando ChimeraX, y la región de la vaina se ajustó de manera flexible mediante simulación de dinámica molecular interactiva en ISOLDE26. El paquete de software PHENIX71 se utilizó para el refinamiento del espacio real. La validación que incluye CC, RMSD de longitudes y ángulos de enlace ideales también se analizó con PHENIX (Figura complementaria 14 y Tabla complementaria 2). Para construir el modelo del tubo interno, primero analizamos todas las proteínas de ϕKp24 usando HMMER72 para identificar la proteína del tubo de cola mediante búsqueda de homología, ya que esto no se anotó en el archivo Genbank. A continuación, predijimos la estructura de la proteína gp119 del tubo de la cola utilizando Alphafold2 y la usamos como plantilla para construir el modelo del tubo interior. El modelo se ajustó rígidamente en las regiones correspondientes del mapa de densidad de cola en ChimeraX, se optimizó en ISOLDE y se refinó en la aplicación PHENIX utilizando el cuerpo rígido y el espacio real. PHENIX analizó las estadísticas de refinamiento y CC, incluido RMSD de longitudes y ángulos de enlace ideales (Figura complementaria 20 y Tabla complementaria 2).

Se entrenó una red neuronal densa de escala mixta de 100 capas39 para detectar fibras de la cola del fago ϕKp24 en tomogramas reconstruidos. Aquí, usamos una configuración de entrenamiento similar a la de otros estudios que usan redes densas de escala mixta56,73,74. Para obtener más información sobre esta configuración de entrenamiento, nos referimos a estos estudios anteriores. Para el entrenamiento, se usaron segmentaciones manuales de las fibras de la cola de siete fagos, además de cinco regiones seleccionadas manualmente sin fibras presentes. Se usó el algoritmo ADAM75 para minimizar la pérdida de entropía cruzada, usando rotaciones y cambios aleatorios para aumentar los datos. El entrenamiento se detuvo después de que no se observara una mejora significativa en la pérdida, lo que resultó en un tiempo de entrenamiento de unas pocas horas. Posteriormente, la red entrenada se aplicó a todos los tomogramas, lo que resultó en mapas 3D de estructuras de fibra de cola. Para analizar más a fondo estos mapas, se realizó una anotación manual adicional en los tomogramas, indicando para cada fago: (1) el centro de la estructura de la fibra, (2) la posición de la cabeza y (3) si la cabeza estaba llena o vacía. , o faltante. Usando esta información, se extrajo un mapa 3D de la estructura de fibra de cada fago de los mapas de fibra 3D, lo que resultó en mapas individuales para 89 fagos con cabezas completas, 338 fagos con cabezas vacías y 181 fagos con cabezas faltantes. Los mapas dentro de cada grupo se alinearon entre sí utilizando tanto la información de posición anotada manualmente como la alineación automática posterior al maximizar la correlación cruzada. Los mapas alineados luego se promediaron para producir formas de fibra 'canónicas' para cada grupo. Las estructuras extraídas y las estructuras promediadas se mostraron usando Paraview76.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los mapas crio-EM 3D generados en este estudio se han depositado en EMDB (el banco de datos de microscopía electrónica, https://www.ebi.ac.uk/emdb/) con el código de acceso EMD-13862 para la cápside vacía del fago jumbo de Klebsiella ϕKp24, código EMD-14356 para la cápside completa del fago ϕKp24 jumbo de Klebsiella, y código EMD-14357 para una longitud de la cola extendida. Los datos de predicción de proteínas informados en este documento serán compartidos por el contacto principal a pedido. Las coordenadas atómicas generadas en este estudio se han depositado en wwPDB (Worldwide Protein Data Bank, http://www.wwpdb.org/) con acceso PDB ID: 8BFL para hexámeros de la cápside vacía del fago ϕKp24 jumbo de Klebsiella, PDB ID: 8BFP para pentámero-hexámeros de la cápside vacía Klebsiella jumbo phage ϕKp24, PDB ID: 8AU1 para una longitud de vaina exterior de la cola extendida, y PDB ID: 8BFK para una longitud de tubo interior de la cola extendida.

Todo el código original se ha depositado en GitHub y está disponible públicamente https://github.com/dmpelt/jumbo-bacteriophage, https://doi.org/10.5281/zenodo.7277351. Cualquier información adicional requerida para volver a analizar los datos informados en este documento está disponible a pedido del contacto principal.

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Descargar referencias

Este trabajo es parte del programa de investigación National Roadmap for Large-Scale Research Infrastructure 2017–2018 con el proyecto número 184.034.014, que está financiado en parte por el Dutch Research Council (NWO). CKC y PJS están financiados por BBSRC, MRC y Wellcome. Los experimentos y análisis de despolimerasa fueron apoyados por el Centro Nacional de Ciencias de Polonia, con los números de subvención UMO-2017/26/M/NZ1/00233 a ZD-K., AL, y UMO-2020/38/E/NZ8/00432 a AOAL tiene una beca posdoctoral junior de la Research Foundation—Flanders (FWO) con el número de subvención 1240021 NDMP cuenta con el apoyo de NWO con el número de subvención 016.Veni.192.235. SJJB cuenta con el apoyo de NWO con la subvención VICI VI.C.182.027 y el CoG del Consejo Europeo de Investigación (ERC) con la subvención no. 101003229. RO recibió el apoyo del Consejo de Becas de China (CSC) con el número de proyecto 201906280465. Agradecemos a Jamie Depelteau y Adam Sidi Mabrouk por la ayuda en la preparación de muestras crio-EM; Wen Yang y Willem Noteborn por la recopilación de datos crio-EM; Ludovic Renault y Frédéric Bonnet por su ayuda en el procesamiento de datos crio-EM; Boris Estrada-Bonilla por el soporte técnico; Xiao Zhang por su ayuda con la extracción de los resultados de la red y Lei Zhang por sus comentarios críticos sobre el manuscrito. Las cepas de referencia de K. pneumoniae utilizadas en este estudio (cepas marcadas con CIP) se obtuvieron de la Colección de l'Institut Pasteur (CIP, París, Francia).

Laboratorio clave del Ministerio de Educación para la síntesis de no equilibrio y la modulación de la materia condensada, Escuela de Física, Universidad Xi'an Jiaotong, Xianning West Road 28, Xi'an, 710049, China

Ruochen Ouyang

Departamento de Ciencias Microbianas, Instituto de Biología, Universidad de Leiden, Sylviusweg 72, 2333 BE, Leiden, Países Bajos

Ruochen Ouyang, Vera CJ Williams y Ariane Briegel

Departamento de Bionanociencia, Universidad Tecnológica de Delft, Van der Maasweg 9, 2629 HZ, Delft, Países Bajos

Ana Rita Costa y Stan JJ Brouns

Instituto Kavli de Nanociencia, Delft, Países Bajos

Ana Rita Costa y Stan JJ Brouns

Departamento de Bioquímica, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

C.Keith Cassidy

Departamento de Biología e Inmunología de Patógenos, Universidad de Wroclaw, Przybyszewskiego 63-77, 51-148, Wroclaw, Polonia

Aleksandra Otwinowska, Agnieszka Latka y Zuzanna Drulis-Kawa

Departamento de Biotecnología, Universidad de Gante, Valentin Vaerwyckweg 1, 9000, Gante, Bélgica

Agnieszka Latka & Yves Briers

Facultad de Ciencias de la Vida y Departamento de Química, Universidad de Warwick, Coventry, CV4 7AL, Reino Unido

Phill J. Stansfeld

Instituto Leiden de Informática Avanzada, Universidad de Leiden, Niels Bohrweg 1, 2333CA, Leiden, Países Bajos

Daniel M Pelt

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Conceptualización: AB, SJJB, YB, ZDK; metodología: AB, RO, YB, ZDK, CKC; software: OI, CKC; análisis formal: RO, CKC, DMP, AL, AO, VW; investigación: RO, ARC, CKC, AO; recursos: AB, SJJB, DMP, YB, ZDK; curación de datos: RO, AB, YB, ZDK; redacción del borrador original: RO, AB, YB, DMP, ZDK; redacción—revisión y edición RO, ARC, CKC, VW, PJS, DMP, SJJ, YB, AL, ZDK, AO; visualización: RO, VW, YB; supervisión: AB, SJJB, YB, ZDK; administración del proyecto: AB; adquisición de fondos: AB, SJJB, CKC, PJS, ZDK, AL, DMP, OR

Correspondencia a Ariane Briegel.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Guy Schoehn y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Ouyang, R., Costa, AR, Cassidy, CK et al. Reconstrucción de alta resolución de un bacteriófago Jumbo que infecta bacterias encapsuladas utilizando fibras de cola hiperramificadas. Nat Comun 13, 7241 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-34972-5

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Recibido: 13 Abril 2022

Aceptado: 14 noviembre 2022

Publicado: 24 noviembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-34972-5

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