Un vínculo entre la señalización de agrin y Cav3.2 en la unión neuromuscular en la atrofia muscular espinal

May 01, 2023

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 18960 (2022) Citar este artículo

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La deficiencia de proteína SMN causa atrofia muscular espinal (AME, por sus siglas en inglés), enfermedad de las motoneuronas. Las terapias basadas en SMN mejoran los síntomas motores del paciente en grados variables. Una de las primeras características de la AME es la perturbación de la unión neuromuscular (NMJ), una sinapsis entre una motoneurona y una célula muscular. La formación de NMJ depende del agrupamiento del receptor de acetilcolina (AChR) desencadenado por agrin y sus correceptores proteína 4 relacionada con el receptor de lipoproteína (LRP4) y la vía de señalización de la quinasa específica del músculo transmembrana (MuSK). Anteriormente hemos demostrado que la flunarizina mejora las NMJ en ratones modelo SMA, pero los mecanismos siguen siendo difíciles de alcanzar. Mostramos aquí que la flunarizina promueve la agrupación de AChR de manera autónoma, dependiente de la dosis y de la agrina en los miotubos C2C12. Esto se asocia con un aumento en los niveles de proteína LRP4, integrina-beta-1 y alfa-distroglicano, tres correceptores de agrina. Además, la flunarizina mejora la interacción de MuSK con la integrina-beta-1 y las fosfotirosinas. Además, el fármaco actúa sobre la expresión y el empalme de los genes Agrn y Cacna1h de manera específica para el músculo. Revelamos que la proteína Cav3.2 codificada por Cacna1h se asocia estrechamente in vitro con el co-receptor LRP4 de agrina. In vivo, se enriquece cerca de las UNM durante el desarrollo neonatal y el fármaco aumenta este inmunomarcaje en los músculos SMA. Por lo tanto, la flunarizina modula a los actores clave de la NMJ e identifica a Cav3.2 como una nueva proteína involucrada en la biología de la NMJ.

La atrofia muscular espinal (SMA) se caracteriza por la degeneración de las motoneuronas espinales y la atrofia muscular. La AME es causada por mutaciones en el gen de la neurona motora de supervivencia 1 (SMN1) que conduce a la reducción de los niveles de proteína SMN1,2. Esta proteína es una proteína de unión a ADN/ARN de expresión ubicua implicada en la regulación de la expresión génica, incluida la transcripción, el empalme, el transporte y la traducción de ARN, siendo la función más caracterizada su papel en la biogénesis de las ribonucleoproteínas nucleares pequeñas ricas en U (snRNP)3, 4,5. En humanos, la presencia de una copia del gen SMN2 proporciona una proteína menos completamente funcional debido a un empalme alternativo del último exón codificante 76. En consecuencia, se observan fenotipos de SMA más leves cuando aumenta el número de copias del gen SMN27,8. Las terapias de AME aprobadas están dedicadas a aumentar los niveles de proteína SMN utilizando la terapia génica SMN o dirigiéndose al pre-ARNm de SMN2 con un oligonucleótido antisentido (ASO) o una molécula pequeña. A pesar de estos tremendos avances científicos y clínicos, varios pacientes no pueden tomar esos medicamentos, otros responden mal y, en ocasiones, se observan efectos adversos9,10,11,12,13. Por lo tanto, una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes a la enfermedad debería contribuir al surgimiento de mejores terapias que sean de importancia clínica.

Se han observado defectos de la unión neuromuscular (NMJ) en la patogenia de la AME antes de la pérdida de motoneuronas consistente con un fenotipo de "muerte regresiva"14,15,16. De hecho, la maduración retrasada, el área de la placa terminal más pequeña y la denervación de la placa terminal se detectan en ratones modelo SMA17,18,19. Una característica distintiva de las UNM es la agrupación de receptores musculares de acetilcolina (AChR) en la membrana del músculo postsináptico mediada por la agrina secretada por las motoneuronas20. Agrin se une al receptor LRP4 y luego, el complejo agrin-LRP4 se une y activa la MuSK transmembrana promoviendo la agrupación de AChR a través de adaptadores como la proteína de acoplamiento 7 (Dok7)21,22. Además, los ratones que carecen del gen funcional Agrn, Lrp4 o Musk mueren perinatalmente.

El gen Agrn produce múltiples isoformas en varios tejidos utilizando dos promotores y empalmes alternativos de los dominios que codifican los exones del extremo C-terminal, como los sitios Y y Z23,24,25. Los primeros exones alternativos codifican los extremos N secretores (NtA) o transmembrana (Tm), siendo este último expresado principalmente en neuronas, mientras que NtA también se expresa en células no neuronales como los músculos26. Las isoformas neurales Z+ agrin agrupan en gran medida los AChR en comparación con el músculo Z-agrin23. Como componentes de la matriz extracelular (MEC), las agrinas también se unen a laminina, heparina, α-distroglicano e integrinas β127,28. Por lo tanto, la agrina también participa en una variedad de funciones: mantiene el NMJ29, promueve la regeneración del corazón30, inhibe el alargamiento de las neuritas31,32,33, regula la sinaptogénesis en el sistema nervioso central34 y coordina una diafonía entre las vías LRP4/MuSK y la integrina-β1 en cáncer de hígado35,36.

El papel de la vía de señalización de agrin/LRP4/MuSK/Dok7 en la enfermedad de AME se subrayó por primera vez mediante la observación de que el exón de agrin Z+ está mal empalmado en las motoneuronas espinales de ratones modelo de AME37, lo que puede corregirse mediante la coexpresión de AAV-9 Proteínas Lsm10 y Lsm11 específicas de U738. La modulación de la señalización de agrina mediante la sobreexpresión de una agrina Z+ transgénica, la inyección de una agrina terapéutica o la administración de AAV-Dok7 mitiga el fenotipo de los ratones SMA39,40,41. Además, el anticuerpo agonista MuSK reduce los defectos neuromusculares en ratones AME42. Por lo tanto, mejorar la función de NMJ a través de la señalización de agrin tiene efectos terapéuticos en la patogénesis en ratones modelo SMA. Sin embargo, la expresión de los exones Agrn distintos de los exones Z+ sigue sin explorarse en gran medida en ratones SMA y después de los tratamientos.

La implicación de las NMJ en la enfermedad de SMA se ilustró aún más cuando informamos que la flunarizina aumenta el área de la placa terminal y la maduración de las NMJ y mejora el fenotipo de la enfermedad en ratones SMA, pero eso independientemente de los niveles de snRNA y de exones Agrn Z+43. Se desconoce el modo exacto de acción sobre la NMJ. La flunarizina se usó anteriormente como un bloqueador de los canales de calcio de tipo T44 y se identificó en una pantalla química como un regulador de empalme45. Tanto los niveles de calcio como el metabolismo del ARN están alterados en los modelos de AME46,47,48,49,50,51. Además, el tratamiento con ASO de ratones SMA mitiga los defectos de empalme de los intrones dependientes de U12 de varios genes, incluido Cacna1h, que codifica el canal de calcio de tipo T Cav3.247.

Luego prevemos una acción de la flunarizina sobre la expresión y el empalme de los genes Agrn y Cacna1h en los músculos esqueléticos. Para abordar esta pregunta, estudiamos cómo flunarizina aumenta el tamaño de NMJ en ratones de control y modelo SMA. Dado que los efectos del fármaco dependen del músculo y son independientes del SMN43, evaluamos los efectos de la flunarizina en miotubos C2C12 murinos cultivados. Informamos que el fármaco estimula in vitro la agrupación de AChR, un evento temprano en la formación de NMJ. Este efecto tiene una dependencia de la concentración similar a la de la inhibición de la corriente Cav3.2, lo que sugiere que requiere el bloqueo del canal. Además, revelamos in vitro e in vivo que la expresión y empalme de los genes Agrn y Cacna1h parecen estar co-regulados por flunarizina. También mostramos que el co-receptor de agrina LRP4 se asocia con Cav3.2 que encontramos localizados cerca de NMJ en el período neonatal murino. Es importante destacar que la flunarizina aumenta el inmunomarcaje de Cav3.2 en los músculos SMA. Por lo tanto, proponemos efectos de flunarizina para asociar Cav3.2 con la formación y maduración de las UNM perinatales.

Previamente mostramos que la flunarizina aumenta las NMJ postsinápticas independientemente de los niveles de proteína SMN en ratones modelo de control y SMA43. Esto implica que los músculos podrían responder directamente a la flunarizina. Para probar esta idea, evaluamos si la flunarizina estimula in vitro la formación de grupos de AChR en mioblastos de ratón C2C12 en cultivo fusionados para formar miotubos (Fig. 1A). Los grupos de AChR se visualizan usando una α-bungarotoxina fluorescente (α-BTX). La flunarizina (4 μM) aumentó significativamente de 3 a 4 veces el número y el tamaño de los grupos (Fig. 1B, E). Además, la agrupación inducida por flunarizina dependía de la dosis (Fig. 1C). La concentración media máxima (EC50) fue de 1,3 μM y 4 μM dieron efectos máximos en la agrupación. También evaluamos la flunarizina en el canal de calcio tipo T Cav3.2 en células HEK293 que expresan de manera estable (Fig. 1D). Los registros electrofisiológicos revelaron que se encuentra una dependencia de la concentración de fármaco similar para la flunarizina en la actividad del canal Cav3.2 (IC50 = 3,44 µM). Es de destacar que el curso temporal de la inhibición de flunarizina ilustra que se alcanza una inhibición máxima por flunarizina 10 µM después de un período de incubación de 5 min (Fig. 7 complementaria). Por lo tanto, la flunarizina estimula la agrupación de AChR muy probablemente a través de una acción directa en el canal Cav3.2, lo que sugiere un papel directo de las células musculares en los efectos beneficiosos del fármaco en ratones modelo de AME.

La flunarizina promueve la agrupación de AChR en los miotubos murino C2C12. (A) Representación esquemática de los cultivos y el tratamiento de células musculares C2C12. (B) Imágenes de fluorescencia de los grupos de AChR con α-bungarotoxina (α-BTX) en miotubos tratados con DMSO y flunarizina (FZ). (C) Una curva de dosis-respuesta de flunarizina de agrupamiento de AChR (3 ≤ n ≤ 5 para cada concentración de 100, 250, 500, 1000, 4000 y 10 000 nM, excepto 2 para 10 μM). (D) Curva concentración-respuesta de los efectos de la flunarizina en los canales Cav3.2. Para cada punto, la densidad de corriente media se normalizó a la densidad de corriente media del grupo de vehículos (7 < n < 24 para cada concentración, las barras de error son SEM). (E) Tanto el tamaño como el número de grupos de AChR aumentaron con el fármaco. Las columnas representan la cantidad de grupos para la misma cantidad de miotubos por condición que se analizaron utilizando ImageJ de 3 experimentos independientes (345 miotubos por condición). (F) Expresión de proteínas endógenas en extractos de proteínas totales de mioblastos C2C12 en medio de proliferación (PM) y miotubos tratados con DMSO y FZ en medio de diferenciación durante 7 días (Diff7). Las células se recolectaron después de un tratamiento con DMSO y FZ durante la noche. La membrana de PVDF se sometió a inmunotransferencia con los anticuerpos indicados con o sin paso de extracción. La α-tubulina sirve como control de carga. Se detecta un aumento del 50% de los niveles de proteína GAPDH en relación con el control de carga de tubulina con el fármaco. Las imágenes no recortadas se encuentran en la Fig. 3 complementaria. (G) Las columnas representan cambios en la expresión de proteínas en miotubos tratados con FZ en comparación con el tratamiento con DMSO (1 μl/ml). (H) Efectos del bloqueo de anticuerpos contra agrina (anti-agrina), integrina β1 (anti-ITGB1) y α-distroglicano (α-Dg1) en la agrupación de AChR en presencia de flunarizina (FZ) en comparación con el control negativo IgG. (I) Las columnas representan el número de grupos (tamaño > 5 μm) de 40 campos seleccionados al azar de cada condición por experimento. Las barras de error representan SD de los valores medios de 3 experimentos independientes. El DMSO diluido se usa en condiciones de control porque la flunarizina es insoluble en solución acuosa. Prueba Khi-2, *, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001. Barra de escala, 30 μm.

Para diseccionar los mecanismos de flunarizina que inducen la agrupación de AChR, examinamos los niveles de proteína de moléculas clave de NMJ centrándonos en la subunidad AChRα, Lrp4, MuSK, distroglicanos (dg), Ca2+/proteína quinasa II dependiente de calmodulina (CaMKII), integrina β1 y α11 en C2C12 miotubos (Fig. 1F,G). No se detectó ningún efecto de la flunarizina (4 μM) en los niveles de proteína de AChRα, MuSK y β-distroglicano, mientras que se observaron aumentos del 30, 50, 60 y 70 % para las integrinas Lrp4, β1 y α11 y el epítopo de α-distroglicano, respectivamente. También consideramos si la sobreexpresión de dynamin2 (Dyn2) induce la agrupación de AChR52 y regula el desarrollo de NMJ53. Se mostró un aumento de los niveles de proteína Dyn2 y GAPDH con flunarizina. No se observaron efectos del fármaco sobre los niveles o la fosforilación de la proteína CaMKII, lo que descarta una posible participación de CaMKII, que también regula la expresión y el agrupamiento de AChR54,55. Los niveles de proteína SMN y Unrip (otro componente del complejo SMN) no cambiaron, como se esperaba56. Por lo tanto, la flunarizina puede promover la señalización de agrina ya que Lrp4/MuSK, las integrinas β1 y el α-distroglicano son todos receptores de agrina involucrados en la biología de NMJ25.

La única fuente de agrin en nuestros experimentos proviene de los miotubos C2C12. Luego preguntamos si los anticuerpos que bloquean agrina, integrina-β1 o α-distroglicano afectaron la agrupación de AChR inducida por flunarizina. Los miotubos se trataron con el fármaco y el anticuerpo monoclonal de ratón anti-agrin Mab520435 o el anticuerpo monoclonal de ratón anti-integrina-β1 Mab196557 o el anticuerpo monoclonal de ratón anti-α-distroglicano IIH6C458 o un anticuerpo de ratón de control negativo (Fig. 1H, I) . En nuestras condiciones, los anticuerpos Mab5204 y Mab1965 inhibieron notablemente la agrupación de AChR, pero no IIH6C4 y los anticuerpos de control. Además, el α-distroglicano se localizó en todos los grupos de AChR en los miotubos tratados con flunarizina (Fig. 4 complementaria), lo que respalda aún más un papel en la estabilización del grupo en lugar de la formación59. Por lo tanto, la agrupación de AChR inducida por flunarizina depende de la agrina y la integrina-β1 in vitro.

Los resultados presentados hasta el momento indicaron que la flunarizina potencia la actividad de agrupación de AChR de la agrina derivada de C2C12. Luego evaluamos si el fármaco podría afectar la expresión del gen Agrn muscular y sus isoformas empalmadas. Las agrinas se expresan a partir de dos sitios de inicio de la transcripción diferentes que dan lugar a dos N-terminales, NtA secretado o TM transmembrana, seguidos de una secuencia común y los exones Y y Z alternativos que codifican la región C-terminal que contiene los sitios de unión para la integrina-β1 y LRP4, respectivamente28 (fig. 2A). Sabiendo que el sitio Z mejora en gran medida la agrupación de AChR60, era posible que la flunarizina pudiera promover la inclusión de los exones Z. De hecho, ilustramos que ni están presentes ni son inducidos por el fármaco en los miotubos C2C12, descartando esta posibilidad (Fig. 2B). Por lo tanto, encontramos que la agrupación de AChR inducida por flunarizina es independiente de la agrina Z+.

Efectos de la flunarizina sobre la expresión y el perfil de empalme del gen Agrn en miotubos C2C12 y músculos esqueléticos de ratones modelo SMA. (A) Representación esquemática de la estructura de la agrina que muestra el uso alternativo del primer exón de la agrina asociada a la lámina basal soluble (NtA) o el dominio que atraviesa la membrana y una región intracelular corta (TM) en el extremo N-terminal y los sitios de empalme "Y" y "Z" de los extremos C con una representación esquemática de los exones Y y Z del gen Agrn. (B) Análisis representativo por RT-PCR en gel de agarosa de los exones Agrn Z en miotubos C2C12 tratados con DMSO y flunarizina (FZ) (Diff7). (C-E) El análisis RT-qPCR de la expresión de los exones NtA, Tm, ex5-6, ex29-30 e Y del gen Agrn se realiza en miotubos C2C12 en comparación con mioblastos en medio de proliferación (PM). El ARN total se prepara a partir de mioblastos C2C12 cultivados en medio de proliferación (PM) o después de 7 días en medio de diferenciación (D7) con DMSO o flunarizina (FZ) durante las últimas 16 h. Se calculan los niveles de ARN en (C), las proporciones de expresión entre los exones y los niveles de ARN ex5-6 en (D) y la proporción de NtA frente a TM en (E). Ex5-6 está incluido en todos los ARNm de Agrn. PM recibió un valor arbitrario de 1 en C y D. (F–N) El análisis RT-qPCR de la expresión de diferentes exones del gen Agrn se realiza en el sóleo (F), plantaris (G) y tibialis (H) de control y ratones modelo SMA en P10. Al vehículo de control se le da un valor arbitrario de 1. Se calculan las proporciones de los primeros exones NtA frente a Tm para el sóleo (I), plantar (J) y tibial (K). Las proporciones de expresión entre los exones y los niveles de ex5-6 se calculan para el sóleo (L), plantar (M) y tibial (N). Se utilizan tres genes como controles para la normalización en C2C12 (Ppia, Gapdh, 5S o Dusp6, Rragc, 5S) y músculos esqueléticos (Rpl13a, Ppia, Myh4). Las barras de error representan SD de los valores medios de triplicados de 3 experimentos independientes con células C2C12 y 3 ratones por grupo. NS no significativo (P > 0,05), *P < 0,05, ** < 0,01, *** P < 0,001. Prueba t de Student.

Para descubrir si se pueden producir otras isoformas de Agrn con flunarizina, diseñamos cebadores de RT-qPCR para exones de Agrn, a saber, NtA, Tm, ex5-6 (incluido en todas las isoformas), ex29-30 (región 3' de todas las isoformas) y el inclusión del inserto en Y (Tabla complementaria 2). La diferenciación de C2C12 se asoció con una disminución en los niveles totales de ARNm de Agrn (ex5-6) y una mayor inclusión del inserto Y (Fig. 2C). Los niveles de NtA no cambiaron tras la diferenciación, pero los niveles de Tm se redujeron notablemente. La flunarizina redujo en ≈25 % los niveles de exón de NtA en los miotubos C2C12 sin cambios en la relación exón/ex5-6 (Fig. 2D). Además, la proporción de NtA versus Tm mostró que hay más isoformas de NtA que de Tm (como se esperaba) y que se observa un aumento de las isoformas de NtA sobre Tm en la diferenciación, así como una reducción por flunarizina (Fig. 2E). Por lo tanto, encontramos que la agrupación de AChR inducida por flunarizina se correlaciona con las isoformas Y + Z- Agrn en los miotubos C2C12.

Para investigar la expresión de Agrn en los músculos esqueléticos, exploramos los niveles de exón de Agrn en tres músculos de las patas traseras, a saber, el sóleo, el plantar y el tibial del control tratado con vehículo (V) y flunarizina (FZ) (heterocigotos) y ratones modelo SMA en el día postnatal. 10 (P10). Estos músculos difieren en términos de maduración, como lo indica la proporción de isoformas de miosina embrionaria y neonatal, y por la composición en fibras tipo I y tipo II43. La maduración de dos músculos extensores (sóleo y plantar) está alterada en ratones modelo SMA, mientras que el flexor tibial está menos afectado, como lo indica la expresión de la cadena pesada de miosina neonatal17,43. Elegimos un punto de tiempo para reflejar efectos específicos en lugar de cambios ante-mortem debido a la muerte mutante en ≈12 días43. Se observó una marcada reducción de 60 a 80 % en los niveles de Agrn ex5-6 en SMA tibialis y soleus respectivamente, mientras que se encontró una modesta reducción de ≈15 % en SMA plantaris en comparación con los controles (Fig. 2F-H). Tanto los exones NtA como Tm se redujeron en SMA soleus mientras que solo NtA estaba en SMA plantaris y tibialis, lo que indica una deficiencia de las isoformas secretoras en los músculos SMA restaurados con flunarizina solo en tibialis. Además, flunarizina aumentó de manera similar los niveles de exón Agrn en el control y SMA tibialis. El exón NtA se expresó preferentemente sobre Tm en los controles y SMA soleus y tibialis, pero se encontró igualmente en SMA plantaris (Fig. 2I-K). Aunque los niveles de ex5-6 se redujeron en el sóleo y plantar de AME tratados con flunarizina, la relación Tm/ex5-6 aumentó, lo que indica que los dos sitios de inicio de la transcripción no son igualmente sensibles al fármaco (Fig. 2L-N). Además, la relación Y exon/ex5-6 mostró con flunarizina un valor similar a los controles en SMA plantaris y tibialis, pero no en soleus. Por lo tanto, la expresión de las isoformas de Agrn se altera en ratones SMA de una manera específica del músculo que modula la flunarizina.

La falta de correlación total entre los niveles de expresión de las isoformas de Agrn (Fig. 2) y la acción de flunarizina en el tamaño de NMJ43 sugiere que eventos adicionales contribuyen a los efectos del fármaco. Debido a que la flunarizina se clasifica como un bloqueador de los canales de calcio de tipo T Cav3.1, Cav3.2 y Cav3.3 codificados por los genes Cacna1g, Cacna1h y Cacna1i, respectivamente44, investigamos si el fármaco podría modular la expresión de Cacna1h. Es de destacar que las transcripciones de Cacna1g y Cacna1i estaban por debajo de nuestros límites de revelación y, por lo tanto, no son detectables. Así, se diseñaron y validaron primers para el análisis de expresión y empalme del gen Cacna1h: ex2-3 (exones que flanquean un intrón dependiente de U12), ex15-16 (incluido en todos los ARNm de Cacna1h), ex25 (exón 25 empalmado alternativo) y cebadores ex32-33 (región 3' en todos los ARNm de Cacna1h) (Tabla complementaria 2, Fig. 3A). Los niveles de Ex15-16 fueron similares entre los mioblastos y miotubos C2C12, mientras que los niveles de ex2-3 y ex25 aumentaron con la diferenciación (Fig. 3B). La flunarizina redujo los niveles de ex15-16 y ex25 en un 50 y un 40 % respectivamente, pero no tuvo ningún efecto sobre los niveles de ex2-3 en los miotubos. Además, evaluamos las proporciones exón/ex15-16 (Fig. 3C). El valor esperado de 1 se obtuvo con el fármaco para la relación ex32-33/ex15-16, mientras que se encontró un aumento de ≈ 3 veces para la relación ex2-3/ex15-16, lo que indica un empalme relativamente mayor del intrón U12 en las transcripciones de Cacna1h. Además, mostramos una reducción del 25% de los niveles de proteína Cav3.2 en miotubos C2C12 tratados con flunarizina (Fig. 3D). Nuestros resultados también confirmaron la especificidad de los anticuerpos usados ​​aquí. Debido a que los intrones U12 se eliminan más lentamente que los intrones U2, dictan los niveles de expresión de los transcritos maduros61. Por lo tanto, la flunarizina disminuye los niveles de ARNm de Cacna1h in vitro que se compensan parcialmente con la eliminación del intrón U12. La entrega del gen snRNA menor mejora el fenotipo de la enfermedad en ratones SMA62. Aunque los niveles de snRNA no cambiaron con el fármaco (Fig. 1 complementaria), nuestros datos asocian los empalmesomas menores U12 como objetivos potenciales del fármaco en los miotubos C2C12.

Efectos de la flunarizina sobre la expresión y el perfil de empalme del gen Cacna1h en miotubos C2C12 y músculos esqueléticos de ratones modelo SMA. (A) Se muestra la representación esquemática del intrón U12 flanqueado por los exones 2 y 3 (ex2-3) y el exón 25 empalmado alternativo del gen Cacna1h. (B) El análisis RT-qPCR de los niveles de ARN de los exones ex2-3, ex15-16, ex25 y ex29-30 del gen Cacan1h se realiza en miotubos C2C12 en comparación con mioblastos en medio de proliferación (PM). (C) Las proporciones de expresión entre los exones y los niveles de ARN de ex15-16, estando presente ex15-16 en todos los ARNm de Cacna1h. El ARN total se prepara a partir de mioblastos C2C12 cultivados en medio de proliferación (PM) o después de 7 días en medio de diferenciación (Diff7) con DMSO o flunarizina (FZ) durante las últimas 16 h. (D) El análisis de inmunotransferencia de la proteína Cav3.2 codificada por Cacna1h confirma una reducción significativa del 20% de los niveles de proteína en extractos de proteína total de miotubos C2C12 por flunarizina (n = 3). Las imágenes sin recortar se encuentran en la Fig. 3 complementaria. (E-G) Los niveles de ARN de los exones de Cacan1h se determinan en P10 en el sóleo, plantar y tibial, respectivamente. (H-J) Las proporciones de expresión entre los exones y los niveles de ARN ex5-6 se calculan para el sóleo, plantar y tibial, respectivamente. Las barras de error representan SD de los valores medios de triplicados de 3 experimentos independientes con células C2C12 y 3 ratones por grupo. NS, no significativo (P > 0,05), *P < 0,05, ** < 0,01, ***P < 0,001. Prueba t de Student.

A continuación, medimos la expresión del gen Cacna1h en los músculos esqueléticos de ratones de control y SMA (Fig. 3E-J). Mostramos que los niveles de ex15-16 en mutantes de SMA, así como los efectos de la flunarizina en los controles y mutantes, eran específicos del músculo. De hecho, se observó una reducción triple de los niveles de ex15-16 en SMA soleus mientras que se encontró un aumento de ≈ 5 veces en SMA plantaris en comparación con los controles (Fig. 3E-G). La flunarizina redujo los niveles elevados de ex15-16 en SMA plantaris pero no restableció los niveles en SMA soleus. Asimismo, a lo observado con el gen Agrn (Fig. 2H), SMA tibialis expresó tantos niveles de ARNm de Cacna1h como los controles y aumentó de manera similar con el fármaco (Fig. 3G). Los niveles alternativos de ex25 aumentaron en SMA plantaris y tibialis en comparación con los controles, mientras que se redujeron en SMA soleus. La flunarizina corrigió la inclusión relativa de ex25 en los ARNm de SMA tibialis pero la incrementó en el control plantaris. La relación ex2-3/ex15-16 se mantuvo baja en la SMA plantar y sóleo tratada con flunarizina, lo que indica que persistió la retención del intrón U12. Es importante destacar que la relación ex32-33/ex15-16 mostró un valor de 1 en SMA plantaris tratada con flunarizina, lo que sugiere un aumento de ARNm de longitud completa con el fármaco.

Se ha detectado corriente de CaV3.2 en miofibras neonatales murinas63. Luego preguntamos si la flunarizina afectaba la distribución de Cav3.2 en las miofibras. Con este fin, realizamos experimentos de inmunofluorescencia de marcaje conjunto utilizando anticuerpos MyHC7 anti-tipo I (fibras lentas de tipo I) y anti-Cav3.2 en secciones en serie de control y SMA plantaris en P5 y P10 (Fig. 4A, Fig. 8). Los ratones SMA comienzan a desarrollar síntomas en P543. Los anticuerpos anti-Cav3.2 revelaron un marcaje citoplasmático y membranoso de las miofibras. Se observó una reducción de la fluorescencia total en las miofibras de Tipo I entre P5 y P10 en todas las condiciones, excepto en los controles tratados con vehículo (Fig. 4B). Las fibras de SMA tipo I tratadas con flunarizina recuperaron la fluorescencia citoplasmática en P10 en comparación con las fibras de SMA tratadas con vehículo. La flunarizina no tuvo efectos sobre la intensidad de fluorescencia total de Cav3.2 de las fibras negativas para MyHC7 (presumiblemente tipo II rápido) en los controles, mientras que se observó un aumento en esas fibras SMA. Por lo tanto, cada tipo de fibra responde de manera diferente a la flunarizina.

La flunarizina previene la reducción del inmunomarcaje de miofibra Cav3.2 durante el desarrollo neonatal en ratones SMA. (A) Se muestra la inmunotinción de la fibra muscular con Cav3.2 (verde) y MyHC7 (rojo) para los plantaris del control tratado con vehículo (V) y flunarizina (FZ) y ratones SMA en P5 y P10, respectivamente. Las imágenes originales se presentan en la Fig. 8 complementaria. (B) Se muestra la intensidad de fluorescencia normalizada de fibras musculares individuales para Cav3.2 detectadas en el panel A. Cada símbolo representa el valor total de la intensidad de fluorescencia en una fibra. El valor medio de la fluorescencia se encuentra en la Fig. 9 complementaria. La distribución de los 4 grupos de ratones de fibras inmunomarcadas o no marcadas con MyHC7 se compara mediante la prueba t de Student. NS no significativo (P > 0,05), *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 (3 ratones por grupo). Barra de escala, 50 μm.

Estudios previos han demostrado la expresión de Cav3.2 en neuronas motoras64,65, vasos sanguíneos66, aferentes sensoriales musculares pero no en células de Schwann67, y todos estos tipos de células están presentes en los tejidos musculares. Aquí nos enfocamos en el etiquetado membranoso Cav3.2 de miofibras y NMJ observando secciones musculares etiquetadas con Cav3.2 en P10 contrateñidas con α-BTX fluorescente para etiquetar AChR (Fig. 5A-D). Nuestros experimentos de inmunofluorescencia mostraron en secciones musculares P5 y P10 que la inmunorreactividad de Cav3.2 era similar a la del marcado con α-BTX fluorescente, lo que indica que Cav3.2 está presente cerca de las NMJ. También mostramos que la flunarizina mejoró la inmunotinción de Cav3.2 cerca de las NMJ en los músculos SMA (Fig. 5D). Por lo tanto, la distribución defectuosa de Cav3.2 en las miofibras podría contribuir a la patogénesis de la AME.

La proteína Cav3.2 se enriquece cerca de la unión neuromuscular y su deficiencia se mejora con flunarizina en los músculos de los ratones SMA. (A) Representación esquemática del inmunomarcaje de Cav3.2 en la NMJ postsináptica. MN neurona motora, SC células de Schwann, SM músculo esquelético. (B) El experimento de fluorescencia de Cav3.2 revela el etiquetado cerca de los sitios postsinápticos de una NMJ usando la tinción α-BTX de AChR y dentro de su neurona motora en secciones de criostato de P5 plantaris de ratones de control tratados con vehículo. La imagen está enfocada con tinción de α-BTX. (C) El experimento de fluorescencia descubre la acumulación de sitios postsinápticos cercanos de Cav3.2 de las NMJ, como se evidencia con la tinción de α-BTX de AChR en secciones de criostato de P10 plantaris de ratones de control (panel superior), la reducción (panel central) y la restauración en ratones SMA con flunarizina (panel inferior). Barra de escala, 10 μm. (D) Se muestra la intensidad de fluorescencia media normalizada de NMJ individual para Cav3.2 detectado en el panel B. Cada símbolo representa el valor medio de la intensidad de fluorescencia de la NMJ individual. La fluorescencia de las fibras de control tratadas con vehículo en P5 recibe un valor arbitrario de 1. La distribución de los 4 grupos de ratones de NMJ inmunomarcada con Cav3.2 se compara mediante la prueba de Mann-Whitney con GraphPad. NS, no significativo (P > 0,05), *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 (3 ratones por grupo, total de 600 NMJ).

Para examinar si la flunarizina modula la interacción proteica entre Cav3.2 y la vía agrin-LRP4-MuSK, los miotubos C2C12 se trataron con el fármaco, se fijaron y evaluaron mediante el ensayo de ligación de proteínas (PLA) de co-inmunoprecipitación en células con anticuerpos generados en diferentes especies y específicas para cada proteína (Fig. 6). Centrándonos en proteínas críticas para la agrupación de AChR, probamos los siguientes pares: LRP4-MuSK, LRP4-Cav3.2, MuSK-integrina β1, MuSK-fosfotirosinas, integrinas α11-β1 e integrina Dyn2 β1. Las señales positivas de PLA entre dos proteínas muy próximas (< 40 nm) aparecieron como puntos fluorescentes que pueden compararse entre miotubos C2C12 tratados con DMSO y flunarizina. Se detectaron señales PLA específicas para todas las combinaciones. Las señales positivas con las combinaciones LRP4-Cav3.2 y LRP4-MuSK fueron indicativas de asociaciones de proteínas constitutivas en miotubos C2C12. También encontramos que flunarizina mejora la asociación de integrina-β1 con MuSK e integrina-α11, mientras que se redujo la asociación Dyn2-integrina-β1 (Fig. 6B). Aunque no se detectó la fosforilación de MuSK en fracciones de proteínas de inmunoprecipitación solubles (Figura 10 complementaria), las señales de PLA generadas con MuSK y fosfotirosinas aumentaron notablemente con la flunarizina. Por lo tanto, la flunarizina cambia la(s) asociación(es) cercana(s) de las proteínas clave de la NMJ.

Visualización de interacciones clave de proteínas NMJ en miotubos C2C12 tratados con flunarizina. (A) Detección in situ de PLA de interacciones de proteínas endógenas en miotubos C2C12 con anticuerpos específicos para los siguientes pares de proteínas: LRP4-MuSK, LRP4-Cav3.2, MuSK-integrina β1, integrina α11-β1, Dyn2-integrina β1 y MuSK- fosfotirosinas. Como controles negativos, se omite un anticuerpo primario o se reemplaza por un anticuerpo de control negativo (DAKO). Las señales positivas de PLA se muestran como puntos brillantes. (B) Se muestra el cambio de veces en la intensidad de fluorescencia media de los miotubos C2C12 individuales detectados en el panel A. El número de miotubos analizados con ImageJ se encuentra en la Tabla 3 complementaria. Barra de escala, 30 μm.

Los daños oxidativos también podrían contribuir a las alteraciones de la UNM en las enfermedades de las motoneuronas68. La flunarizina reduce el prooxidante TXNIP en los fibroblastos de pacientes con AME56 al igual que otros bloqueadores de los canales de calcio en las células beta pancreáticas69. Curiosamente, las transcripciones de Txnip aumentaron en los músculos sin células satélite (SC) en comparación con los músculos SC repletos70, lo que recuerda el número reducido de SC en los músculos de los ratones SMA71,72,73. Examinamos la expresión de Txnip en músculos de ratones SMA tratados con flunarizina (Fig. 7). La flunarizina redujo los niveles de ARNm de Txnip regulados al alza en los músculos SMA (Fig. 7A). Los experimentos de marcaje conjunto de inmunofluorescencia con anticuerpos contra TXNIP y MyHC7 (fibras tipo I) revelaron que todas las miofibras neonatales eran positivas para TXNIP, con un 2 % fuertemente marcado en los controles, mientras que el 16 % estaba en el sóleo de la SMA y se reducía al 10 % con flunarizina (Fig. .7B,C). Esto encaja con la alta expresión de TXNIP en músculos de ratones y ratas adultos en desuso74. Por lo tanto, la flunarizina reduce los niveles elevados de ARNm de Txnip en los músculos de los ratones SMA.

La flunarizina reduce los niveles aumentados de expresión de Txnip en los músculos esqueléticos de ratones modelo SMA. (A) Niveles de ARN de Txnip en el sóleo, plantar y tibial en controles tratados con vehículo (V) y flunarizina (FZ) (Ctrl) y ratones modelo SMA. El control tratado con vehículo (Ctrl V) recibe un valor arbitrario de 1. NS no significativo (P > 0,05), *P < 0,05, ** < 0,01, ***P < 0,001, prueba t de Student (3 ratones por grupo ). (B) Se muestra inmunotinción de fibra muscular con anticuerpos anti-TXNIP (verde) y anti-MyHC7 (rojo) para el sóleo de ratones SMA y control tratados con vehículo y flunarizina en P11. (C) Las columnas representan el porcentaje de fibras fuertemente positivas para TXNIP (3 ratones por grupo). Las barras de error representan SD de los valores medios. Barra de escala, 30 μm.

Existen tres terapias de restauración de SMN para pacientes con AME que mejoran la supervivencia y la función motora, pero aún así la respuesta del paciente a los tratamientos es variable. Por lo tanto, se deben identificar objetivos terapéuticos adicionales para optimizar las terapias existentes para la AME o implementar otras nuevas. Anteriormente, hemos demostrado que la flunarizina aumenta el tamaño de las miofibras, el área de la UNM y la inervación en ratones modelo SMA43. Nos centramos aquí en los músculos esqueléticos para evaluar la flunarizina en las NMJ. Mostramos que la flunarizina puede modular las vías de señalización de agrina, involucradas en la formación y maduración de la NMJ, lo que proporciona una mayor comprensión de la patogénesis de la AME.

Los modelos de ratón con enfermedad de motoneurona y los pacientes presentan defectos de la NMJ75,76. La disfunción sináptica es un evento temprano en la AME que genera cambios en los circuitos sensoriomotores77,78,79. La AME es una neuropatología retrógrada en la que la degeneración de las motoneuronas comienza en las UNM presinápticas y progresa hacia los cuerpos celulares15. En modelos de ratones con AME grave, el número de motoneuronas es normal al nacer y disminuye alrededor del día 3 posnatal a 580,81. La maduración de la NMJ posnatal ocurre durante las primeras 3 a 4 semanas después del nacimiento. Durante este período, las UNM aumentan de tamaño y su morfología cambia de placas ovaladas a perforadas para alcanzar una forma similar a la de un pretzel82. La corriente Cav3.2 es alta en las miofibras perinatales, disminuye progresivamente durante las 3-4 semanas posteriores al nacimiento y es indetectable en los músculos adultos, excepto durante la regeneración y reparación muscular63. Este período de desarrollo tiene una gran demanda de SMN y es cuando el fenotipo motor causado por la deficiencia de SMN puede ser rescatado por terapias basadas en SMN83,84,85. También es cuando las terapias independientes de SMN mejoran el fenotipo de la enfermedad12,43,86,87,88.

La vía agrin/LRP4/MuSK estimulada mejora la AME y la esclerosis lateral amiotrófica (ELA)89. Agrin es una molécula clave en la biología de la NMJ postsináptica. Los cambios en las isoformas de agrina impactan en la formación, maduración y estabilidad de la NMJ23. El gen Agrn tiene exones Y y Z empalmados alternativos. Las isoformas con sitios Z (Z+) son sinaptogénicas en las NMJ, mientras que las isoformas sin ellos (Z-) tienen poca actividad de agrupamiento de AChR in vivo90. Las motoneuronas expresan Z+ agrin mientras que las células musculares no lo hacen. Z-agrin también tiene funciones: puede modular la fosforilación de AChR91, estimular la expresión génica de AChR92,93 y, en determinadas condiciones, inducir la agrupación de AChR60,94,95. Z-agrin puede unirse a proteínas de la superficie celular de los miotubos, como la molécula de adhesión de células neurales, α-distroglicano, lamininas e integrinas28,96,97,98,99. Z+ agrin también puede unirse a estas proteínas, pero el α-distroglicano se une más fuertemente a Z-agrin que a Z+ agrin. Además, el sitio Y cambia las interacciones, y la agrina Y–Z− exhibe la mayor unión a α-distroglicano90. El sitio Y modulado por flunarizina también implica la actividad de α-distroglicano en la respuesta en los músculos SMA.

En el día 10 postnatal, cada músculo esquelético es muy diferente en términos de maduración. El MyHC embrionario persiste durante un tiempo después del nacimiento. El sóleo es el músculo menos maduro, ya que se encuentra una mayor proporción de fibras embrionarias (60%) que en plantaris (30%) y tibialis (20%)43. Dos promotores de Agrn producen transcripciones con el primer exón de NtA o Tm que codifica isoformas secretadas o transmembrana, respectivamente. Tanto las motoneuronas como las miofibras expresan el exón NtA, que codifica un dominio de unión a laminina27. Se ha demostrado que las motoneuronas deficientes en Smn derivadas de ratones SMA no responden a las lamininas100, lo que es coherente con una reducción de NtA-agrina. La marcada reducción de NtA que observamos también en los músculos SMA indica una expresión alterada en ambos tipos de células. Los exones NtA y Tm no se ven afectados por igual en los músculos SMA y responden de manera diferente al fármaco en una forma específica de desarrollo/músculo, comportándose como controles los tibialis SMA más maduros. Tm exon in vivo se expresa casi exclusivamente por las neuronas27 y en los músculos, por las neuronas que inervan las miofibras. Se observan diferentes niveles de exón Tm entre los músculos SMA, lo que sugiere una diferencia en las motoneuronas esqueléticas101 y/o en las señales retrógradas de las miofibras14.

Aunque un nivel de exón de Tm umbral se correlaciona con los efectos de la flunarizina sobre el tamaño de la NMJ en SMA plantaris y tibialis43, se deben considerar mecanismos adicionales para explicar cómo ocurre en SMA plantaris (niveles de Tm similares entre el vehículo y la flunarizina). Se ha demostrado que el sitio Y modula Tm-agrin en especializaciones similares a sinapsis excitatorias en el sistema nervioso central34. Estos autores propusieron que se requiere una interacción indirecta de Tm-agrin y LRP4 para agrupar proteínas en la membrana postsináptica. Es posible que Cav3.2 pueda mediar interacciones indirectas. Otros estudios han demostrado que la integrina-β1 podría mediar en la interacción entre la agrina y el α-distroglicano28,57. Por lo tanto, es tentador especular que Cav3.2 podría ser un co-receptor de agrina en la diferenciación temprana de NMJ postsináptica.

En cuanto al gen Cacna1h (que codifica Cav3.2), su empalme del intrón dependiente de U12 del gen Cacna1h está alterado en ratones SMA47. La enfermedad de motoneuronas ELA y una amiotrofia congénita severa se asocian con variantes genéticas de Cacna1h como factores de riesgo102,103,104,105. Curiosamente, otros tipos de canales de calcio, a saber, el tipo P/Q, limitan la localización y activación de MuSK y previenen la agrupación de AChR en dominios extrasinápticos de miofibras106. Es interesante que un bloqueador de los canales de calcio tipo T pueda modular la expresión de Cacna1h a nivel de ARN y proteína. El motivo podría ser la baja selectividad del fármaco por los canales Cav3107. Es tentador especular que la inhibición de los canales de tipo T explica parcialmente los efectos de la flunarizina. La acción prolongada de la flunarizina sobre la inhibición de la corriente Cav3.2 respalda la función de este canal (Figura 7 complementaria). La flunarizina podría promover un ciclo de retroalimentación en la expresión de Cacna1h al alterar los niveles de Ca2+ intracelular que contrarresta los defectos de la NMJ en la SMA plantar y tibial. Esto está de acuerdo con el papel del metabolismo del ARN alterado en SMA y ALS108 y los efectos de la flunarizina en el empalme del ARN45. Nuestros resultados también tienen una amplia relevancia en otras enfermedades humanas, lo que sugiere que la flunarizina podría ser perjudicial en pacientes jóvenes afectados por una canalopatía causada por mutaciones dominantes negativas de Cav3.2109.

El calcio es un regulador clave en la biología del músculo esquelético. La formación y el mantenimiento de grupos de AChR involucraron calcio intracelular y extracelular110,111. En los músculos murinos, la corriente de Cav3.2 alcanza su punto máximo alrededor del día embrionario E16 que coincide con el paso de maduración embrionaria tardía de NMJ. De hecho, los grupos aneurales de AChR están presentes en E11-12.5, luego se produce la inervación (E12.5-E14) y los grupos aneurales se dispersan en E14-E17 y solo quedan grupos inervados en las miofibras20. La miogénesis también ocurre en este período. Desde E14.5 hasta el nacimiento, los mioblastos se adhieren y fusionan a las fibras primarias para formar miofibras secundarias112. La corriente Cav3.2 se activa in vitro cuando los mioblastos se fusionan para formar miotubos113. Esto puede explicar el tamaño muscular reducido en ratones SMA. El número reducido de miofibras en SMA soleus y plantaris43 se correlaciona aquí con los niveles reducidos de ARN de Cacna1h. La flunarizina aumenta el tamaño y el número de fibras para reducir la atrofia de SMA soleus, pero solo aumenta el tamaño de fibra para corregir la atrofia en SMA plantaris43. El crecimiento posnatal del músculo ocurre normalmente por aumentos en el área de fibras pero no en el número de fibras20,114. Estas observaciones podrían señalar una diferencia en los tipos de miofibras y su respectiva expresión de Cav3.2, como se ve aquí. El sóleo presenta una proporción del 50-50% de fibras lentas tipo I y rápidas tipo II. Los plantaris y tibialis contienen una pequeña proporción de fibras tipo I (10-20%) que desaparece casi por completo durante el desarrollo posnatal. Los niveles de calcio en reposo son más altos en las fibras lentas que en las rápidas. Por lo tanto, los transitorios de calcio tienen efectos diferentes en cualquiera de las fibras debido a las diferencias de nivel en las proteínas que controlan la homeostasis del calcio. El calcio puede activar la fosfatasa calcineurina regulada por calmodulina y puede activar las proteasas dependientes del calcio. En las miofibras lentas, la calcineurina regula la translocación nuclear del factor de transcripción NFATc1 controlando el programa del gen lento. Además, el aumento de la entrada de calcio a través de Cav3.2 induce la señalización hipertrófica de calcineurina cardíaca/NFAT115. Dado que el manejo del calcio está alterado en SMA50, la flunarizina podría modular la expresión de otros genes musculares aún por identificar en el futuro.

Nuestra observación de Cav3.2 se encuentra muy cerca de LRP4 en los miotubos C2C12 plantea la cuestión de su localización potencial cerca de las NMJ durante el desarrollo perinatal. Podemos especular, pero aún no entendemos por completo por qué Cav3.2 se localiza cerca de las NMJ. Una característica interesante de Cav3.2 es la existencia de un dominio de unión a PDZ en su extremo C citoplasmático116. Las proteínas PDZ podrían controlar la actividad de los canales de calcio, regular la densidad de su membrana plasmática e influir en las vías de señalización aguas abajo117. Varias proteínas de andamiaje PDZ se encuentran en la UNM postsináptica, incluida la óxido nítrico sintetasa neuronal (nNOS) y la α-sintrofina118,119, MAGI-1c120 y el dominio PDZ que contiene el dedo RING 3 (PDZRN3)121. Por lo tanto, la localización NMJ de Cav3.2 puede explicarse por el informe anterior de que el dominio PDZ de nNOS interactúa in vitro con el dominio de unión a PDZ de Cav3.2122. Esto es particularmente interesante en el contexto de SMA y ALS, donde la inmunotinción para nNOS se reduce/elimina en el sarcolema de fibras atróficas en biopsias musculares de pacientes y se conserva en fibras hipertróficas (indicativas de inervación) en biopsias de SMA123,124. Este resultado es digno de mención en muchos aspectos con los efectos de la flunarizina en los músculos del ratón SMA. La actividad de nNOS regula la homeostasis del calcio125, promueve la agrupación de AChR in vivo y aumenta los NMJ126. Con respecto al desarrollo de NMJ, la inducción Wnt del agrupamiento de AChR es compleja. El análisis de ARN identificó la expresión de Wnt4 y Wnt9a en miotubos C2C12127 que no se modifican con la flunarizina ni con las subunidades AChR y los objetivos YAP aguas abajo (Figuras complementarias 5 y 6). Explorar el papel de Wnt en el agrupamiento de AChR inducido por flunarizina podría proporcionar información adicional en el futuro. Teniendo en cuenta las pocas vías desreguladas en los músculos esqueléticos de embriones de ratón SMA128 con vías musculares desreguladas después del nacimiento37,88,129,130, nuestros hallazgos apuntan a la importancia de investigar los efectos de los fármacos durante el desarrollo neonatal en ratones SMA. Con una mejor comprensión de las respuestas a flunarizina, puede ser posible extender los tratamientos existentes a terapias combinadas contra enfermedades de motoneuronas.

Las células musculares C2C12 se cultivaron en placas de cultivo TPP en DMEM-glutamax suplementado con suero de ternero fetal (FCS) al 20 % y penicilina y estreptomicina (100 unidades/ml) y se diferenciaron en DMEM-glutamax que contenía suero de caballo al 2 %. Después de 6 días en medio de diferenciación, los miotubos se trataron durante la noche con flunarizina (4 μM, según lo recomendado por Sigma-Aldrich para la biblioteca Lopac L6912, corriente de calcio Cav3.2 IC50) o DMSO (1 μl/ml) como se muestra esquemáticamente en la Fig. 2a . Para los experimentos con anticuerpos bloqueantes (1:100, según la literatura), se añadieron a los miotubos una hora antes que las moléculas. Para la microscopía de fluorescencia, los miotubos se enjuagaron con PBS y se fijaron durante 15 min a temperatura ambiente con paraformaldehído (PFA) al 3 % en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,4 y se enjuagaron en PBS. Los grupos de AChR se visualizaron usando Alexa Fluor 488 o α-bungarotoxina conjugada (2 μg/ml, Molecular Probes). Para la transferencia Western, los extractos de proteínas totales se resolvieron en gel de poliacrilamida ProSieve 50 al 10 % (FMC Bioproducts, Rockland, ME) en tampón de ejecución Tris-Tricine, se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore) y se incubaron con los anticuerpos enumerados en la Tabla 1 complementaria. En el paso de lavado de la incubación con anticuerpos secundarios conjugados con HRP, las proteínas se visualizaron mediante quimioluminiscencia (Amersham ECL, GE Healthcare) y se cuantificaron mediante el análisis de gel de ImageJ. Para los registros electrofisiológicos, HEK293 que expresaba establemente hCaV3.2 se cultivó en DMEM con alto contenido de glucosa complementado con FBS al 10 %, L-glutamina 1 mM, penicilina/estreptomicina 1 mM y se completó con 800 µg/ml de geneticina G418.

Para los registros electrofisiológicos, las células tratadas con tripsina se centrifugaron a 800 rpm durante 4 min y se resuspendieron (≈ 350.000 células ml-1) en solución extracelular de pinza de parche. Se utilizaron grabaciones de células completas para investigar los efectos de la flunarizina en las células HEK293 que expresan Cav3.2. Las grabaciones de pinzamiento de parche automatizadas se realizaron utilizando el SyncroPatch 384PE de Nanion (München, Alemania). Se utilizaron chips con orificios simples de resistencia media (n = 384) para los registros electrofisiológicos. La generación de pulsos y la recopilación de datos se realizaron con el software PatchControl384 v1.9.7 (Nanion) y la interfaz Biomek (Beckman Coulter). Los registros de células completas se realizaron de acuerdo con los procedimientos recomendados por Nanion. Las células se almacenaron en un depósito de hotel de células a 10 °C con una velocidad de agitación de 60 RPM. Después de iniciar el experimento, la captura de células, el sellado, la formación de células completas, la aplicación de líquidos, el registro y la adquisición de datos se realizaron de forma secuencial y automática. La solución intracelular contenía (en mM): 10 CsCl, 110 CsF, 10 NaCl, 10 EGTA y 10 HEPES (pH 7,2, osmolaridad 280 mOsm), y la solución extracelular contenía (en mM): 60 NMDG, 80 NaCl, 4 KCl , 10 CaCl2, 1 MgCl2, 5 Glucosa y 10 HEPES (pH 7,4 con NaOH). Los experimentos con células completas se realizaron a un potencial de mantenimiento de -100 mV a temperatura ambiente (18–22 °C). Las corrientes se muestrearon a 20 kHz. Para los ensayos farmacológicos, se prepararon soluciones de flunarizina a diversas concentraciones en la solución extracelular suplementada con albúmina de suero bovino al 0,3 % y se distribuyeron en placas compuestas de 384 pocillos según un plan de placas preestablecido. Esta distribución dentro de placas compuestas no podría aleatorizarse ya que posteriormente complicaría excesivamente los métodos de análisis. La solución del compuesto de trabajo se diluyó 3 veces en el pozo de registro de la abrazadera de parche agregando de 30 a 60 µL de solución externa para alcanzar la concentración final informada y el volumen de prueba de 90 µL. Para los grupos de control, las soluciones de vehículo eran extracelulares y contenían BSA al 0,3 % y DMSO al 0,1 % (que era similar a la concentración de DMSO en la solución de flunarizina 10 µM). Los efectos de la flunarizina se midieron todo el tiempo durante un tiempo de aplicación de 10 minutos con un protocolo de un solo paso que contenía un período de potencial de retención de 50 ms a 100 mV seguido de un pulso de 400 ms a -10 mV. Este protocolo de un solo paso se repitió con un intervalo de 10 s.

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices ARRIVE y los protocolos aprobados por el comité de protección animal de la Université de Paris (CEEA 34) respetando las directrices europeas y francesas para el cuidado y uso de animales de laboratorio (2010/63/EU) bajo los números de referencia 01246.02 y B75-06-07. A los ratones taiwaneses SMA se les inyectó diariamente desde el nacimiento flunarizina (500 µg/ml, 1 µl/g) o vehículo (DMSO al 1% en solución salina) como se describe43. Los ratones SMA tienen antecedentes de FVB/NRj (Janvier, Le Genest-St-Isle, Francia) y se han retrocruzado durante 10 generaciones como se describe. Se asignó un número a cada animal y, salvo que se indique lo contrario, los experimentos se realizaron a ciegas para el genotipo, el tratamiento y los estudios moleculares y celulares. La asignación del grupo se reveló para los análisis. No se utilizaron criterios de exclusión. Tanto mujeres como hombres fueron incluidos en el estudio. El modelo de AME taiwanés grave (Smnko/ko; SMN2tg/0) y los ratones heterocigotos de control correspondientes (Smnko/wt; SMN2tg/0) se produjeron en la misma camada. Basándonos en nuestros resultados anteriores43, estudiamos tres ratones por grupo experimental para minimizar el número de animales utilizados. Los cuatro grupos eran ratones de control y modelo SMA tratados con vehículo y flunarizina para un total de 59 ratones. Los ratones se genotiparon con los cebadores de PCR S1, S2, H1, 2B y 2F131. Brevemente, se estableció una reacción de PCR multiplex con 1 µl de ADN (20 ng), 5 µl de tampón flexible GoTaq verde 5X, 2,5 µl de MgCl2 25 mM (2,5 mM final), 1 µl de mezcla de dNTP 10 mM (2,5 mM cada dNTP, 200 µM final), 1,5 µl 10 µM S2 cebador directo (0,6 µM final), 0,75 µl 10 µM 2F cebador directo (0,3 µM final), 0,75 µl 10 µM S1, H1, cebadores inversos 2B (0,3 µM final) y 0,15 µl GoTaq ADN polimerasa (Promega). Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: 5 min a 95 °C, luego 30 s a 95 °C, 1 min a 58 °C, 45 s a 72 °C durante 33 ciclos y un paso final de extensión de 5 min a 72 °C. Los productos de PCR S2-S1 (1150 pb), S2-H1 (950 pb) y 2F-2B (478 pb) se analizaron en un gel de agarosa al 1%. Los mutantes de SMA y sus compañeros de camada heterocigóticos se anestesiaron mediante inyecciones intraperitoneales de pentobarbital (64 mg/kg) y se decapitaron en P5 o P10. Se diseccionaron tres músculos esqueléticos (sóleo, plantar, tibial), se congelaron instantáneamente y se almacenaron a -80 °C. Los experimentos de inmunofluorescencia en criosecciones musculares (10 μm) se realizaron como detallamos previamente43. Brevemente, las secciones se fijaron en PFA al 4 % en PBS durante 20 min, se bloquearon en FCS al 20 % o BSA al 4 % durante 30 min y se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C. Después de 1 h en PBS-Tween (0,1 %), las secciones se incubaron durante 2 h con anticuerpos secundarios. Después de la tinción y los lavados con bis-benzimida (o DAPI), las secciones se montaron con solución de fluoromount-G. Los anticuerpos utilizados se enumeran en la Tabla complementaria 1.

Las imágenes se tomaron con una cámara ORCA Flash 2.8 (Hamamatsu Photonic) montada en un sistema de microscopio de epifluorescencia (AxioObserver Z1, ZEISS). Se utilizaron los softwares ZEN e ImageJ para adquirir y analizar las imágenes, respectivamente. Brevemente, las regiones de interés (ROI) se seleccionaron al azar y se dibujaron manualmente usando las imágenes de canal de campo claro con ImageJ. Para los análisis de intensidad de fluorescencia de las fibras musculares, primero se ajustó el nivel de umbral para eliminar cualquier señal de fondo y se midieron los valores grises medios de las fibras musculares marcadas con Cav3.2 para las fibras marcadas con tipo I o sin marcar (presumiblemente tipo II). ) para cada grupo de ratones.

El tamaño de los grupos de AChR en miotubos C2C12 se determinó con ImageJ mediante la medida de los agregados de AChR (≥ 6 a 10 μm) en campos de microscopio 20x seleccionados al azar (40 campos por experimento, n ≥ 3 experimentos independientes) o de cien fibras por experimento (n = 3).

El ensayo de ligadura de proximidad in situ (PLA) se realizó como describimos132. Brevemente, las células C2C12 se fijaron y permeabilizaron como antes. Los anticuerpos primarios (Tabla complementaria 1) se diluyeron en el diluyente de anticuerpos (kit DuolinkII, Sigma-Aldrich) y se incubaron durante la noche a 4 °C. Los controles negativos consistieron en utilizar un único anticuerpo primario. Las células se lavaron dos veces durante 5 min en solución salina tamponada con Tris con Tween al 0,05%. Las sondas PLA (ratón-PLUS y conejo-MINUS) se incubaron durante 1 h a 37 °C. Los pasos posteriores se realizaron utilizando el reactivo de detección Orange. Las señales se vieron como puntos con un microscopio de fluorescencia y se analizaron con ImageJ.

El ARN total se extrajo de tejidos y cultivos celulares utilizando Trizol Reagent (Ambion) y se trató con una ADNasa libre de ARNasa RQ1 (Promega). Se usó un µg de ARN para generar ADNc con el kit miScript II RT (Qiagen) para análisis de ARNsn y Superscript III (Invitrogen) para los otros genes. La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó por triplicado utilizando los cebadores enumerados en la Tabla complementaria 2 con la mezcla SYBR Green ROX (Thermo Scientific) en el sistema rápido Applied Biosystems 7500 o BioRad CFX384. Los niveles de expresión normalizados se calcularon según el método ΔΔCt. Los cebadores snRNA, 5 S, 5.8 S, Rpl13a, Ppia, Gapdh, Myh4 y Z+ Agrn y sus análisis han sido descritos previamente43. Se diseñaron cebadores adicionales utilizando las herramientas gratuitas de diseño de cebadores de eurofins (eurofinsgenomics.eu) y se validaron de acuerdo con las directrices MIQE.

Al menos tres experimentos independientes se presentaron como la media ± SD o SEM. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el Kruskal Wallis no paramétrico seguido de la prueba de rango de comparación múltiple de Dunn o ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey o la prueba t de Student (GraphPad). La prueba utilizada se indica en las leyendas de las figuras. El umbral significativo fue del 5%.

Los cálculos detallados realizados durante y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Agradecemos a la instalación central de BioMedTech Instalaciones INSERM US36 | CNRS UMS2009 | Université de Paris Cité por su asistencia en experimentos con animales, biología molecular y microscopía. Deseamos agradecer a Pr R Barouki, J Cartaud y F Charbonnier por su apoyo constante. Agradecemos a M Nabi y PE Fontaine por su ayuda técnica durante su pasantía académica. Agradecemos a los colegas por la lectura crítica del manuscrito y la generosa provisión de protocolos y reactivos.

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud e Investigación Médica (INSERM, instalaciones y salario para SL), el Centro Nacional de Investigaciones Científicas (CNRS, instalaciones) y la Université Paris Cité (instalaciones y salario para PD, BS y DS). Las concesiones CONV-16-SMA-Lefebvre y ANR-21-CE17-0039-01 a SL son de SMA Europe y ANR, respectivamente.

Estos autores contribuyeron por igual: Perrine Delers y Delphine Sapaly.

T3S, INSERM, Universidad Paris Cité, 75006, París, Francia

Perrine Delers, Delphine Sapaly, Badih Salman y Suzie Lefebvre

The Thorax Institute, INSERM, CNRS, Universidad de Nantes, 44000, Nantes, Francia

Stephan De Waard y Michel De Waard

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PD, DS, BS, SDW, MDW y SL realizaron experimentos. Análisis realizados por PD, DS, BS, SDW, MDW y SL. SL concibió el proyecto y escribió el manuscrito. Todos los autores comentaron el manuscrito.

Correspondencia a Suzie Lefebvre.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Delers, P., Sapaly, D., Salman, B. et al. Un vínculo entre la señalización de agrin y Cav3.2 en la unión neuromuscular en la atrofia muscular espinal. Informe científico 12, 18960 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-23703-x

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Recibido: 20 enero 2022

Aceptado: 03 noviembre 2022

Publicado: 08 noviembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-23703-x

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